Количественное определение белка
ПРИНЦИП МЕТОДА:
Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:
1) NaCl, 0,9 %; 2) биуретовый реактив: 0,15 г CuSO4 · 5H2O и 0,6 г NaKC4H4O6 · 4H2O (виннокислый натрий-калий, или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10%-ого раствора NaOH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в полиэтиленовой склянке; 3) стандартный раствор альбумина (БСА – бычий сывороточный альбумин), 10 мг белка в 1 мл; 4) раствор сыворотки с разведением в 10 раз: взять 1 мл сыворотки крови довести дистиллированной водой или 0,9 % раствором NaCl до объема 10 мл. Полученная концентрация белка будет соответствовать 6,5-8,5 г/л; 5) пробирки, пипетки; 6) ФЭК.
ХОД РАБОТЫ:
1. Опытная проба: к 4 мл биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 1 мл приготовленного раствора сыворотки крови с 10-ти кратным разведением.
2. Контрольная проба: к 1 мл раствора хлорида натрия приливают 4 мл биуретового реактива.
Пробы делают в 2-х повторениях!
Через 45-50 мин опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при длине волны 540 нм против контрольной пробы (либо против дистиллированной воды).
3. Расчет ведут по калибровочной кривой. Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 4.
Таблица 4
Данные для построения калибровочного графика
| № пробы | Рабочий р-р биуретового реактива (мл) | Стандартный р-р белка (мл) | 0,9 % р-р NaCl или дист Н2О (мл) | Содержание белка в пробе (г) | Концентрация белка (г/л) |
| 1. | 0,2 | 0,8 | 0,002 | 2,0 | |
| 2. | 0,4 | 0,6 | 0,004 | 4,0 | |
| 3. | 0,6 | 0,4 | 0,006 | 6,0 | |
| 4. | 0,8 | 0,2 | 0,008 | 8,0 | |
| 5. | 1,0 | 0,010 | 10,0 |
При построении калибровочной кривой серию стандартных растворов обрабатывают так же, как и опытные пробы. Пробы перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭКе при 540 нм против дистиллированной воды.
Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с растворов наименьшей концентрации.
Пробы делают в 2-х повторениях!
По результатам измерений строится калибровочная кривая. Средние значения оптической плотности (А) 2-х повторений (соответствующие различным концентрациям) наносят на миллиметровую бумагу на оси ординат, на оси абсцисс откладывают значения концентрации стандартных растворов белка (С).
Полученную по графику концентрацию белка в исследуемой опытной пробе умножают на величину разведения (х10).
Значения концентрации общего белка в сыворотке крови практически здоровых людей составляет 65-85 г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
Опишите физико-химическую характеристику пептидной связи. Почему пептидные связи являются основой строения белка?
Как определить количество вещества с использованием калибровочной кривой?
Какова концентрация общего белка в сыворотке крови здорового человека?
Тема 4
ГИДРОЛИЗ БЕЛКА. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ
Гидролиз – распад сложного вещества на более простые составные части, связанный с присоединением воды по месту разрыва связей. В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе, как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.
При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.
Лабораторная работа №9