При необходимости после хроматографического разделения и проявления алкалоидов аналогичным способом можно определить сенецифиллин, пользуясь тем же калибровочным графиком

Построение калибровочного графика. 0,2890 г (точная навеска) гидротартрата платифиллина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, объем раствора доводят до метки "95%-ным этиловым спиртом и перемешивают. Получают таким обра­зом 0,2%-ный исходный раствор платифиллина-основания. Для построения ка­либровочного графика, рассчитанного на работу в кювете с толщиной слоя раст­вора 50 мм, наносят на стартовую линию хроматограммы в разные точки (0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07 мл) исходного раствора, что соответствует 20, 40, 60, 80, 100, 120 и 140 мкг платифиллина-основания, и далее анализируют, как описано выше. Для кюветы с толщиной слоя раствора 10 мм берут 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 мл исходного раствора, что соответствует 100, 200, 300, 400 и 500 мкг платифиллина-основания, и далее анализируют, как описано выше

При построении калибровочного графика на оси абсцисс откладывают коли­чество мкг вещества, содержащегося в пятне хроматограммы, а на оси ординат — оптические плотности соответствующих колориметрируемых растворов.

Приготовление пластинок для хроматограммы. Смешивают 95 г порошка силикагеля с 5 г CaS0₄; к 1,5 г этой смеси добавляют 4 мл 0,1 н. раствора NaOH и размешивают до консистенции «жидкой сметаны». Полу­ченную смесь наливают ровным слоем на стеклянную пластинку 6 X 18 см. Пла­стинку с сорбентом сушат на воздухе в течение 18 ч.

Реактивы и оборудование: H₂S0₄ 5%-ная; НС1 1%-ная; аммиак (конц. р-р); цинк металлический (цинковая пыль); этиловый эфир; этиловый спирт; хлороформ; фенолфталеин; кремневольфрамовая кислота; Na₂S0₄ (без- водн.); CaS0₄; тропеолин 000-II; реактив Драгендорфа; платифиллин гидротарт- рат; вода дистиллированная; силикагель марки КСК; бумага фильтровальная; вата гигроскопическая; колбы вместимостью 100, 200 и 1000 мл; колбы мерные вместимостью 50 мл; воронки делительные вместимостью 250—300 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 и 10 см; цилиндры мерные на 10, 100 и 500 мл; пластинки стеклянные для ТСХ размером 6 X 18 см; камеры хро- матографические для ТСХ; микропипетки измерительные вместимостью 0,2 мл; бюксы с притертой крышкой; эксикатор; бани водяные лабораторные; весы руч­ные; весы лабораторные аналитические; сито с диаметром отверстий 2 мм; ступка фарфоровая с пестиком; электрокофемолка бытовая; фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М; шкаф сушильный лабораторный; штативы лабораторные.

Н

СН3 эрготамин эргометрин

Н-- 14---

Методика количественного определения алкалоидов в рожках_я спорыньи эрготаминового штамма (Cornua Secalis cornuti stamm Ergotamini) (ФС 42-1432-80). Рожки спорыньи, паразитирующей на ржи, содержат индольные алкалоиды — производные лизерги- новой и изомерной ей изолизергиновой кислот. Основными являются эргометрин, эрготамин, эргокристин, эргокриптин, эргокорнин и др.:

Количественное определение алкалоидов проводится колориметри­ческим методом. 3 г (с погрешностью не более 0,01 г) свежеизмель- ченного порошка спорыньи, просеянного сквозь сито с размером отверстий 0,315 мм, обезжиривают в аппарате Сокслета в течение 8 ч петролейным эфиром (температура кипения 40—60 °С). Обезжи­ренный порошок высушивают при температуре не выше 30 °С и пе­реносят количественно в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, приливают 30 мл этилового эфира и оставляют на 10 мин. Затем прибавляют 0,13 г свежепрокаленного оксида магния, тща­тельно растертого с 6 мл воды; смесь непрерывно встряхивают в течение 2 ч, затем прибавляют 6 г безводного Na₂S0₄, сильно встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться и быстро процежи­вают через вату. 15 мл фильтрата (1,5 г спорыньи) помещают в де­лительную воронку и извлекают 4 раза по 20 мл 2%-ным раствором винной кислоты; колбу с объединенными виннокислыми извлече­ниями помещают на водяную баню и нагревают до 40—50 °С для удаления остатков эфира.

Охлажденный раствор процеживают через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл, колбу и воронку с ватой тщательно промы­вают 2%-ным раствором винной кислоты и доводят объем раствора до метки той же кислотой (раствор А). К 2 мл раствора А прибав­ляют 4 мл реактива ван-Урка, перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭК-М с зеле­ным светофильтром (длина волны 530—540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Процентное содержание эргоалк^лоидов в сырье х вычисляют по формуле

_ а200- 100-100 1,5 (100—ш) '

где а — количество эргоалкалоидов в 1 мл раствора А, г, найден­ное по калибровочному графику; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика готовят серию разведений эрготамина тартрата-стандарта (ФС 42-1070-76) в 2%-ной винной кислоте разбавлением исходного раствора эрготамина тартрата- стандарта. Для этого сначала готовят исходный раствор: точную навеску 0,0113 г эрготамина тартрата-стандарта (0,0100 г основания) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 2%-ной винной кислоте и доводят этой же кислотой до метки. Полученный раствор содержит 0,0001 г эрготамина-основания в 1 мл (исходный раствор). В пробирках вместимостью 10 мл готовят следующий ряд разбав­лений раствора (см. табл. на стр. 156).

К полученным растворам прибавляют 4 мл раствора ван-Урка, тщательно перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин, после чего колориметрируют в тех же условиях, что и в основном опыте. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество граммов эрготамина-основания, а на оси ординат —

Количество исходного ра­створа, мл	Количество 2 % ного раст вора винной кислоты, мл	Количество эрготамина- основания в 1 мл, г	Количество исходного ра­створа, мл	Количество 2 %-ного раст­вора винной кислоты, мл	Количество эрготамина- основания в 1 мл, г
0,10	1,90	0,000005	0,60	1,40	0,00003
0,20	1,80	0,00001	0,70	1,30	0,000035
0,30	1,70	0,000015	0,80	1,20	0,00004
0,40	1,60	0,00002	0,90	МО	0,000045
0,50	1,50	0,000025	1,00	1,00	0,00005

соответствующее значение оптической плотности колориметрируе- мых растворов.

Для определения содержания эрготамина на стартовую линию хроматографической бумаги марки «С» (55 X 16 см) узкой полоской наносят из микропипетки 0,4 мл эфирного извлечения (0,04 г спо­рыньи). Бумагу импрегнируют 50%-ным спиртовым раствором формамида, рН которого 7,05—7,20, оставляя стартовую линию в 2 см сухой; тщательно отжимают избыток формамида между листами фильтровальной бумаги, стартовую линию опрыскивают из пульверизатора тем же раствором формамида. В течение 10 мин полоску бумаги высушивают на воздухе в темном месте.

Хроматографирование проводится в затемненной камере нисхо­дящим методом, в системе бензол — петролейный эфир (/_КИп — = 70—100 °С) (6:1) до продвижения фронта 40—45 см, после чего бумагу высушивают и просматривают в ультрафиолетовом свете, отмечают светящуюся полоску эрготамина. Эту полоску вырезают по всей ширине бумаги — с одного конца вырезают зубчики, другим концом помещают в кювету с 1 %-ной винной кислотой, которая находится в камере, насыщенной водой, и алка­лоиды элюируют 1 %-дой винной кислотой, элюат собирают в про­бирку с делениями. За 18 ч собирают 3—6 мл элюата, доводят водой до 8 мл, тщательно перемешивают. К 2 мл полученного раст­вора прибавляют 4 мл реактива ван-Урка и через 30 мин колори- метрируют в тех же условиях, что и при определении суммы алка­лоидов.

По калибровочному графику находят содержание эрготамина в 1 мл испытуемого раствора. Процентное содержание х вычисляют по формуле

_ а8 • 100 ■ too

⁴ ~ 0,04 (100-а») '

где а — количество эрготамина в 1 мл испытуемого раствора, г, найденное по калибровочному графику; w — потеря в массе сырья при высушивании, %. Содержание эрготамина в пересчете на абсо­лютно сухое сырье должно быть не менее 0,2 %.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика точную навеску 0,0113 г эрготамина тартрата-стандарта (0,0100 г эрготамина-основания) растворяют в 10 мл метилового спирта. На стартовую линию хроматографической бумаги марки «С» (55 X 16 см) узкой полоской наносят из микропипетки на первый лист 0,05 мл, на второй — 0,1, на третий —0,15, на четвертый —0,2 мл этого раствора (50, 100, 150, 200 мкг), далее поступают, как описано выше.

При количественном определении алкалоидов в рожках спорыньи на лабо­раторных занятиях указанную навеску сырья (3 г) предварительно обезжиривают; калибровочный график студенту дается готовый.

Реактивы и оборудование: петролейный эфир (<_киП = 40—60 и 70—100 °С); этиловый эфир; бензол; этиловый спирт (этанол); MgO, Na₂S0₄ (безводн.); винная кислота; эрготамин тартрат; формамид (50%-ный раствор в этиловом спирте); реактив ван-Урка (H₂S0₄ кони.,FeCl₃, п-диметиламинобен- зальдегид).

Бумага хроматографическая; бумага фильтровальная; колбы с притертой пробкой вместимостью 100 мл; колбы конические вместимостью 100 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; воронки делительные вместимостью 100 мл; стаканы химические вместимостью 200 мл; колбы мерные вместимостью 100 и 200 мл; пипетки измерительные вместимостью 2 и 5 мл; цилиндры мерные на 10 и 100 мл; бюксы с притертой дсрышкой; пробирки вместимостью 10 мл; ка­мера хроматографическая для БХ; эксикатор; пульверизатор; штативы для де­лительных воронок; бани водяные лабораторные; аппарат Сокслета; шкаф су­шильный лабораторный; УФ лампа; весы ручные; весы лабораторные аналити­ческие; сито с размером отверстий 0,315 мм; фотоэлектроколориметр ФЭК-М.

Методика количественного определения секуринина в побегах секуринеги (Cormus Securinegae) (ФС 42-109). Побеги секуринеги полукустарниковой Securinega suffruticosa (Pall.) Rehd. сем. моло­чайных — Euphorbiaceae содержат алкалоиды — производные кон­денсированной бициклической системы пиперидина и пирролидина:

о

II

секуриыив

Количественное определение секуринина в сырье проводится полярометрическим методом. 100 г воздушно-сухого сырья, измель­ченного до величины частиц 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 2000 мл и заливают 1000 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы взбалтывают 5 мин и оставляют до следующего дня. После этого повторно взбалтывают 5 мин и водную вытяжку отфильтровывают.

600 мл водного фильтрата помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл, подщелачивают концентрированным раство­ром аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извлекают хлороформом 3—4 раза порциями 100, 50 и 50 мл до полного извлечения (проба с раствором кремневольфра­мовой кислоты).

Из объединенного хлороформного извлечения алкалоиды извле­кают 10%-ной H₂S0₄ 2—3 раза по 50 мл в делительной воронке вместимостью 500 мл. Объединенный сернокислый раствор вновь подщелачивают концентрированным раствором аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извле­кают этиловым эфиром 4—5 раз по 30—50 мл (проба с раствором кремневольфрамовой кислоты). Объединенные эфирные извлечения сушат безводным Na₂S0₄ (10—15 г) и фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу. Промывают сульфат натрия небольшими порциями этилового эфира до отсутствия алкалоидов и фильтруют через тот же фильтр. Эфир обгоняют на водяной бане досуха. Оста­ток эфира удаляют струей воздуха.

Сухой остаток в колбе растворяют в 5 мл 95 %-ного этилового спирта и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем раствора доводят до метки этиловым спиртом, тща­тельно перемешивают и определяют угол вращения в трубке дли­ной 0,5—2,0 дм (поляриметр марки СМ).

1. Для приготовления 10%-ной H_sS0₄ берут 1 часть конц HaS0₄ и 9,5 ча­стей Н_гО.

2. При отгонке эфира следует избегать перегрева кристаллизующихся алка­лоидов. Выделенные алкалоиды необходимо сразу же растворить в 95%-ном эти­ловом спирте, не оставляя на следующий день.

Процентное содержание секуринина х вычисляют по формуле

aWilOO • 100 * V_am/1080 (100—w) »

где а — измеренный угол вращения, градусы; V — объем раство­рителя, взятого для извлечения алкалоидов, мл; У*— объем извле­чения, взятого для анализа, мл; V₂ — объем этилового спирта, взятого для растворения алкалоидов, мл; т — масса навески сырья^-, г; I — толщина слоя жидкости (длина трубки), дм; w — потеря в массе сырья при высушивании, %; 1080 — удельное вра­щение чистого секуринина.

Содержание секуринина должно быть не менее 0,1 % на абсо­лютно сухое сырье.

Реактивы и оборудование: аммиак (конц. р-р); HjSOj1%-ная; кремневольфрамовая кислота; этиловый эфир; этиловый спирт (этанол); вода ди­стиллированная; хлороформ; Na₂S0₄ (безводн.); фенолфталеиновая бумага.

Бумага фильтровальная; колбы конические вместимостью 250 и 2000 мл; цилиндры мерные на 10, 100 и 1000 мл; колбы мерные вместимостью 25 мл; во­ронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 и 10 см; воронки делительные вместимостью 500 и 1000 мл; установка для отгонки этилового эфира; поляри­метр; штативы для делительных воронок; весы лабораторные аналитические; весы ручные; бюксы с притертой крышкой, эксикатор; сушильный шкаф лабора­торный

Методики количественного определения берберина в корнях барбариса обыкновенного (Radix Berberidis vulgaris).

Корни барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris L.) сем. барбарисовых — Berberidaceae содержат алкалоиды производные изохинолина: берберин, ятроррицин, пальматин и др. Считают, что берберин может быть как в форме четвертичного аммонийного

ill

Количественное определение берберина спектрофотометрическим методом (ФС 42-1152- 78). Количественное определение берберина в корнях барбариса по данной методике основано на селективном извлечении берберина в его карбинольной форме и отделении от алкалоидов фенольной природы на стадии экстракции сырья.

В УФ спектре бисульфата берберина в 2%-ной H_aS0₄ имеется ряд интенсивных полос поглощения- Для количественного опреде­ления в данном методе используется наиболее длинноволновая полоса поглощения (Я_тах = 420 нм).

Для определения* содержания берберина от средней пробы цельного сырья отделяют не менее 1 кг, который измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм, тща­тельно перемешивают, отбирают не менее 250 г сырья, которые измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отвер­стий 3 мм. Затем отбирают 25 г сырья и доводят его измельчение до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм.

основания (I), так и в альдегидной (II) или карбинольной форме (III):

I II

0-,5 г (с погрешностью не более 0,0001 г) сырья помещают в ко­ническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл (с притертой пробкой), прибавляют 0,5 мл 25%-ного NaOH, тщательно пере­мешивают стеклянной палочкой до получения однородной увлаж­ненной массы, закрывают пробкой и оставляют при комнатной температуре на 2 ч. Затем в колбу прибавляют 50 мл этилового эфира, закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью не бо­лее 0,01 г). Содержимое колбы осторожно перемешивают круго­выми движениями в течение 10 мин, взвешивают и потерю массы пополняют этиловым эфиром. Содержимое колбы вновь осторожно перемешивают, дают отстояться, затем берут осторожно, не взму­чивая сырье, пипеткой 15 мл эфирного извлечения, помещают

в делительную воронку вместимостью 100 мл и проводят извлече­ние алкалоидов 2 %-ной H₂S0₄ порциями 20, 10 и 10 мл (до отрица­тельной реакции с кремневольфрамовой кислотой). Объединенные кислотные извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки 2%-ной H₂S0₄. После тщательного перемешивания раствор спектрофотометрируют при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Процентное содержание берберина бисульфата х в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле

50 • 50 • 100D 15 • 128т (100 — ш) '

где 50 — объем эфирного извлечения, мл; 50 — объем сернокислого извлечения, мл; 15 — объем эфирного извлечения, взятого для ана­лиза, мл; 128 — удельный показатель поглощения берберина бисульфата при длине волны 420 нм; D — оптическая плотность сернокислого извлечения; т. — масса навески сырья, г; w — по­теря в массе сырья при высушивании, %.

Реактивы и оборудование: NaOH; этиловый эфир; H₂S0₄ 2%-ная; кремневольфрамовая кислота

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 мл; колбы мер­ные вместимостью 50 мл; воронки делительные вместимостью 100 мл; пипетки из­мерительные 1 и 15 мл; цилиндры мерные на 10 и 50 мл; бюксы с притертой крыш­кой; эксикатор; штативы для делительных воронок; шкаф сушильный лаборатор­ный; весы лабораторные аналитические, технические, ручные; сита с диаметром отверстий 1, 3 и 7 мм, спектрофотометр СФ-4А.

Количественное определение берберина спектрофотометрическим методом с приме- , нением хроматографии в tqhkom слое сор­бента. Метод основан на разделении алкалоидов в тонком слое сорбента и определении содержания берберина спектрофотометри­ческим методом.

Точная навеска (0,5—1 г) измельченных корней барбариса, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в колбу вместимостью 50 мл, приливают 10 мл 95%-ного этилового спирта и нагревают с обратным холодильником на водяной бане, поддерживая слабое кипение этилового спирта в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры отмеряют микро­пипеткой 0,2 мл извлечения (надосадочной жидкости) и наносят на стартовую линию хроматографической пластинки с закреплен­ным слоем силикагеля сплошной полосой длиной 5—7 см на рас­стоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Для определения зоны берберина в правой части пластинки на стартовую линию наносят раствор берберина бисульфата (3—5 капилляров) в виде пятна (диаметр пятна 0,5—0,7 мм).

После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру. Для проявления используется система: раствор аммиака концентрированный — хлороформ —'этиловый спирт (1:3: 3). Си­стема растворителей используется для хроматографирования одно­кратно. Толщина слоя растворителей в хроматографической камере около 5 мм; экспозиция при комнатной температуре 30—40 мин.

Хроматограмму после высушивания просматривают в УФ свете, отмечают на хроматограмме зону, соответствующую берберину, и соскабливают этот участок сорбента скальпелем в колбу вмести­мостью 25 мл. Берберин 4 раза элюируют 0,1 н. H₂S0₄ при нагре­вании в течение 1 мин на водяной бане. Кислоту отмеряют с по­мощью бюретки: первый раз 4 мл, а затем три раза по 2 мл. Пол­ноту элюирования определяют по отсутствию флюоресценции сили­кагеля в УФ свете. Элюат каждый раз сливают декантацией в дру­гую колбу вместимостью 25 мл. Для удаления следов силикагеля объединенный элюат центрифугируют в течение 5 мин (1000 об/мин). Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре СФ-4А на фоне контроля при длине волны 345 нм в кювете с тол­щиной слоя 1 см. Контролем служит элюат чистого силикагеля с той же пластинки, снятый с площади, равной площади пятна берберина. Процентное содержание берберина в обрйзце х рассчи­тывают на абсолютно сухую массу сырья в пересчете на бисульфат берберина:

_ VV, 100Р * V_tmт (100—да) '

где V — объем этилового спирта, взятого для извлечения, мл; Vx — объем извлечения, нанесенного на хроматограмму, мл; V₂ — объем элюата берберина, мл; D — оптическая плотность элюата; w — потеря в массе сырья при высушивании, %; т — масса на­вески сырья, г; (646) — удельный показатель поглощения берберина бисульфата.

Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); CaS0₄; аммиак (конц); H₂S0₄ (0,1 н.); хлороформ; силикагель марки КСК-

Колбы с нормальным шлифом вместимостью 50 мл; холодильники обратные стеклянные лабораторные с нормальным шлифом; микропипетки измерительные вместимостью 0,2 мл; капилляры стеклянные; бюретки вместимостью 10, 25 мл; колбы конические вместимостью 25 мл; бани водяные лабора1Ърные; цилиндры мерные на 10 и 100 мл; бюксы с притертой крышкой; камера хроматографическая для ТСХ; пластинки стеклянные для ТСХ размером 13 X 18 см; штативы лабора­торные; центрифуга лабораторная; УФ лампа; шкаф сушильный лабораторный; сито с диаметром отверстий 1 мм; весы ручные; весы лабораторные аналитиче­ские, спектрофотометр СФ-4А

Вопросы для подготовки

1. Какие природные вещества называют алкалоидами (определение)?