Тема: Регуляция активности ферментов

ЦЕЛЬ: Изучить механизмы регуляции каталитической активности ферментов, посредством которых клетки координируют и регулируют весь набор метаболических процессов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ

Вопросы для самоподготовки:

1. Активаторы и ингибиторы ферментных реакций. Приведите примеры.

2. Классификация ингибиторов. Обратимое и необратимое ингибирование.

3. Ингибиторы конкурентные и неконкурентные. Как можно на практике отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного?

4. Аллостерические ингибиторы и активаторы.

5. Регуляция активности ферментов по типу обратной связи – ретроингибирование. Механизм обратной связи – главный биологический механизм регуляции обменных процессов.

6. Полиферментные системы. Какова их биологическая роль?

7. Образование ферментов в виде проферментов. Биологический смысл этого явления. Превращение проферментов в ферменты на примере протеиназ пищеварительного тракта.

8. Лекарственные препараты – ингибиторы ферментов. Приведите примеры.

9. Четвертичная структура аллостерических ферментов и кооперативные эффекты.

Выполните следующие задания:

1. Известны главные каталитические группы в активных центрах ферментов: для карбоксипептидазы - арг 145, тир 248, глу 270; для лизоцима – трп 62, трп 63, асп 101; для химотрипсина – гис 57, сер 195, асп 102. Ответьте на вопросы:

А) Какие из этих ферментов быстро инактивируются в присутствии диизопропилфторфосфата, почему, какой тип ингибирования?

Б) Какие из этих ферментов образуются путём протеолитической активации из проферментов?

2. Метанол очень токсичен. Приём 30 мл может привести к гибели человека. Высокая токсичность обусловлена действием на организм продукта метаболизма метанола – формальдегида. Метанол быстро окисляется в него ферментом печени – алкогольдегидрогеназой. Одним из методов лечения при отравлениях метанолом является назначение больному этанола в больших количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным?

3. Объясните механизм лечебного действия трасилола при панкреатите. В норме поджелудочная железа защищена от протеолитического действия синтезируемых ею ферментов, в частности, трипсина. Это обеспечивается тем, что ферменты синтезируются в виде проферментов и их активация проходит в тонком кишечнике. Кроме того, в секрете поджелудочной железы присутствует ингибитор – полипептид, инактивирующий трипсин. Трасилол является структурным аналогом этого пептида.

4. Холинэстераза при оптимальных условиях (рН – 8,4; температура 37°С) в течение 15 минут катализирует гидролиз ацетилхолина с образованием 100 ммоль холина и уксусной кислоты (напишите реакцию). Рассчитайте активность фермента. Объясните, как и почему изменится активность фермента, если:

1. Температуру инкубационной среды изменить от 5 до 40°С.

2. В инкубационную среду добавить препарат «прозерин»

O

СН₃ || CH₃

СН₃ N⁺ С N CH₃SO₄

СН₃ CH₃

3. В присутствии прозерина повышать концентрацию ацетилхолина.

5. Сравните действие прозерина и диизопропилфторфосфата (ДФФ) на фермент ацетихолинэстеразу (в активном центре функциональная группа серина).

1. Ингибирует ацетилхолинэстеразу 2. Конкурирует с субстратом за место в активном центре 3. Действует необратимо 4. Ингибирование устраняется избытком ацетилхолина

А. Только прозерин Б. Только ДФФ В. Оба вещества Г. Ни одно из этих веществ

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ.

I. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

Порядок выполнения работы. В три пробирки вносят реактивы согласно нижеследующей схеме (количество указано в каплях).

№№ пробирок	Н2О	Хлористый натрий, 1%	Сернокислая медь,1%	Слюна/вода, 1:10	Раствор крахмала, 1%
		‑ -	- -

Через 5 минут инкубации при комнатной температуре по 2 – 3 капли содержимого опытных пробирок переносят в пробирки с водой, подкрашенной каплей раствора йода. Наблюдается различная степень расщепления крахмала. Если расщепление крахмала недостаточно во всех пробах, опыт повторяют через 5 минут.

Оформить результаты работы в виде таблицы:

Фермент	Субстрат	Время действия фермента	Окраска йодом
Проба 1	Проба 2	Проба 3

Сделать вывод о характере влияния добавок на активность амилазы слюны.

II. Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы мышц.

Фермент сукцинатдегидрогеназа катализирует реакцию окисления янтарной кислоты до фумаровой (кофермент ФАД). В данном опыте реакция регистрируется по изменению окраски 2,6-дихлорфенолиндофенола синего (при восстановлении обесцвечивается).

Прядок выполнения работы: Для получения ферментного препарата 1 – 2 г свежей мышечной ткани, предварительно измельчённой ножницами, растирают в ступке с небольшим количеством воды, затем мышечную кашицу переносят на двойной слой бинта, помещённого в воронке, и промывают 25^ю мл воды. Промытую мышечную кашицу отжимают, переносят в пробирку и суспендируют в 4 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию (фермент прочно связан с внутриклеточными структурами) равномерно распределяют в 4 пробирки. Содержимое первой пробирки кипятят в течение 2 – 3 минут для инактивации фермента. Затем в пробирки добавляют реактивы по следующей схеме:

№№ пробирок	Сукцинат, 1% мл	Дист. вода Мл	Малонат, 1% Мл	2,6-дихлорфенол-индофенол, 1%
	-	0,5 0,5 1,5 -	- - - 0,5	2 капли 2 капли 2 капли 2 капли

Через 15 минут наблюдается исчезновение синей окраски только во второй пробирке. Объясните, почему не идёт реакция в пробирках № 1 и № 3 и почему снижена скорость реакции в пробирке № 4.

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ. Основная:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002, с. 145-157, 122-126.

2. Биохимия: Учебник/Под ред. Е.С. Северина. –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003, (Серия XXI век), с. 102-108.

3. Николаев А.Я. Биологическая химия, М.: Медицинское информационное агентство, 2001, с. 78-81, 84-89.

4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия: Учебник. –М.: Медицина, 2000, с. 22-29.

5. Лекционный материал.

Дополнительная литература:

1. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Под ред. член-корр. РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2001. -448 с.: ил. – (XXI век).

2. Клиническая биохимия /Под ред. В.А. Ткачука –М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. -360 с. –(Серия XXI век)

3. Клиническая биохимия /Пер. с англ. –М. –СПб.: «Издательство Бином» - «Невский Диалект» 1999. -368 с., ил.

4. Марри Р. и соавтор. ‘‘Биохимия человека’’ М.: Мир, 1993, т. 1.