Краткие сведения из теории.

ИЗУЧЕНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СВЕТА

НА КЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ

Учебное пособие

для выполнения лабораторных работ

по курсу

«Основы взаимодействия физических полей с биообъектами»

Под редакцией И.Н. Спиридонова

Москва 2002 г.

Цель работы: ознакомление с современным методом лечения злокачественных опухолей и других трудноизлечимых заболеваний - методом фотодинамической терапии (ФДТ) на примере наблюдения фотодинамического эффекта (ФДЭ) на взвеси эритроцитов.

Введение.

Лазерная фотодинамическая терапия – наиболее современный и наименее травматичный метод лечения онкологических заболеваний.

Суть метода состоит в избирательном воздействии лазерного излучения на патологические клетки, предварительно активированные введением специального вещества – фотосенсибилизатора (ФС). ФС должен обладать рядом специфических свойств, характеризующих его эффективность. Главные из них: селективное накопление в патологических клетках; избирательное и достаточно высокое поглощение излучения на рабочей длине волны лазера; способность с максимальной эффективностью передавать поглощенную энергию внутриклеточному кислороду и тем самым запускать фотохимические реакции, приводящие к гибели патологических клеток при минимальном воздействии на нормальные клетки. В качестве ФС могут выступать естественные (эндогенные) вещества, участвующие в метаболизме клеток (хлорофилл, порфирин). На их основе разработаны лечебные препараты порфиринового ряда, так называемые производные гематопорфирина (ПГП), (ФОТОФРИН в США и Канаде, ФОТОСАН в Германии и Европе, ФОТОГЕМ в России). Исходным веществом для изготовления этих препаратов является кровь. На сегодня в зарубежной практике разрешены к применению только такие препараты. В России, кроме того, разрешен к ограниченному применению синтетический препарат ФОТОСЕНС, представляющий собой металлопорфириновый комплекс с участием цинка или алюминия (относящийся к группе фталоцианинов).

Механизм ФДТ еще не изучен до уровня повседневных методических рекомендаций, поэтому каждый медицинский центр, где применяется ФДТ, является одновременно и научным центром. Идет непрерывный поиск и исследование новых, более эффективных, ФС и постоянное совершенствование технических средств (лазерные источники, средства доставки излучения к объекту, средства дозиметрического контроля процесса и управляющие устройства). Возможности метода не ограничиваются онкологией. Имеются интересные сообщения о применениях ФДТ в кардиологии, микробиологии, дерматологии и ряде других областей.

Краткие сведения из теории.

Основным процессом, ответственным за фотодинамический эффект (ФДЭ), можно считать передачу энергии возбуждения от ФС к внутриклеточному кислороду. При поглощении кванта света hν молекула ФС переходит из основного S₀ в возбужденное S^* состояние (рис.1). Оба эти состояния синглетны, т.е. спины внешних электронов в молекуле ФС антипараллельны, и суммарный спин равен нулю, а спиновое число S = 1 (S = 2s +1, где s – суммарный спин). Переход S₀®S^* вследствие этого наиболее вероятен. Ближайшее к S^* возбужденное состояние, расположенное чуть ниже, является триплетным (спины внешних электронов параллельны, s = 1 и S = 2s+1 = 3). Оно не может непосредственно заселяться из основного состояния S₀ , поскольку действует правило отбора по спину (переход S₀ ® T^* примерно в 10⁴ – 10⁶ раз менее вероятен, чем S₀ ® S^*). Но ввиду малой разницы энергий S^* и T^* состояний возможен переход молекулы ФС из S^* в T^* состояние за счет спин-орбитального взаимодействия, смешивающего состояния с различной спиновой мультиплетностью. Можно найти ряд ФС, у которых вероятность перехода g_ик из S^* в T^* , называемого интеркомбинационной конверсией, близка к единице (g_ик ³ 0,8). Поскольку из-за тех же правил отбора излучательный переход T^*® S₀ запрещен, время жизни триплетного состояния T^* много больше (t_т* ~ 10^-1 ¸ 10^-4 с), чем время жизни синглетного возбуждённого состояния (t_S* ~ 10^-8 ¸ 10^-9 с). Происходит, тем самым, аккумуляция молекул ФС в состоянии T^*. Этого не могло бы происходить, если бы отсутствовала интерконверсия, и вся поглощенная энергия высвечивалась бы обратно в виде флуоресценции S^* ® S₀ (время жизни состоя ния S^* относительно перехода S^* ® S₀ + hν_фл составляет t_s* ~ 10^-8¸10^-9 c). Некоторый, вообще очень слабый, фон флуоресценции всегда присутствует (g_ик < 1) и может быть зарегистрирован достаточно чувствительными приемниками излучения. Поскольку характерной особенностью ФС для ФДТ является преимущественное накопление в опухолевых клетках, повышение интенсивности флуоресценции по сравнению с фоном, характерным для нормальных клеток, является признаком патологии и составляет основу метода люминесцентной диагностики, часто предшествующей ФДТ. Однако легко видеть, что требования к ФС, определяющие его эффективность для терапии и диагностики, противоположны. Для диагностики необходимо, чтобы g_ик ® 0, для терапии – наоборот, g_ик ® 1. Аккумуляция ФС в Т^* состоянии делает возможной эффективную передачу энергии возбуждения другим молекулам с образованием свободных радикалов. В данном случае наиболее вероятна передача энергии возбуждения молекуле кислорода. Основное состояние молекулы кислорода ³О₂ является триплетным, тогда как ближайшие возбужденные состояния синглетны (¹О₂*). Наиболее устойчивым из них является состояние ¹D_g, отстоящее от основного на ~ 0,976 эВ (l = 1,27 мкм). Ввиду различной мультиплетности состояния ¹D_g и основного ³О₂ возможна аккумуляция молекул кислорода в состоянии ¹D_g. Характерное время жизни синглетного ¹D_g кислорода (¹О₂*) в жидкой среде сильно зависит от типа среды и может меняться в пределах 1 ¸ 10^-5 с. При наличии в среде возбужденных молекул ФС в состоянии Т^*, энергия которого близка к энергии состояния ¹D_g , весьма вероятно перекрытие электронных оболочек молекул ФС и кислорода с резонансным заселением ¹D_g состояния кислорода. Этот процесс можно схематически изобразить в виде (см. рис. 1):

T*[­][­] + ³O₂[¯][¯] ® S₀[¯][­] + ¹O₂*[­][¯]

т.е. электрон с возбужденной орбитали ФС переходит на возбужденную орбиталь ¹D_g кислорода, а с самой низкой (основной) орбитали кислорода электрон переходит на вакансию в основном состоянии ФС.

рис.1. Схема передачи энергии возбуждения от ФС к синглетному кислороду.

Синглетный кислород более активен при взаимодействии с внутриклеточными веществами, чем кислород в основном состоянии ³О₂. При этом возможен как физический механизм передачи возбуждения, по типу передачи энергии от ФС к самому кислороду без изменения химического состава, так и химический, при котором кислород вступает в реакцию с соответствующим веществом. Поскольку в обоих случаях не происходит радиационных переходов, вещества, принимающие энергию возбуждения от синглетного кислорода, называются тушителями. Вещества-тушители всегда присутствуют в клетках и межклеточной среде, нейтрализуя избыточный синглетный кислород. Преобладание физического механизма тушения означает отсутствие фотодинамического эффекта (ФДЭ). Это имеет место в отсутствие ФС, когда синглетный кислород образуется под влиянием естественных факторов (например, при повышенном солнечном облучении). Для реализации же ФДЭ необходимо включение химического механизма тушения, при котором в реакцию с возбужденным ¹О₂* вступают ненасыщенные соединения, входящие в состав белков и липидов. Итак, требуемый ФДЭ можно схематически изобразить в виде цепочки реакций:

S₀ + hn (1)

Здесь обозначено:

S₀ - невозбужденное (синглетное) состояние ФС;

s - эффективное сечение поглощения света молекулой ФС;

I₀ - интенсивность падающего излучения [Вт/см²];

S* - возбужденное синглетное состояние ФС;

T* - возбужденное триплетное состояние ФС;

g_ик – квантовый выход интерконверсии;

³O₂ – невозбужденное (триплетное) состояние молекулы кислорода;

¹O₂* - возбужденное синглетное состояние молекулы кислорода;

RH₂ - химический тушитель (субстрат) – внутриклеточное либо входящее в состав мембран или межклеточной среды вещество, активно взаимодействующее с синглетным кислородом и дающее окисленный продукт R , непосредственно воздействующий на метаболизм клетки с летальным для нее исходом.

ФДЭ можно ослабить или усилить в присутствии веществ, либо сильно взаимодействующих с синглетным кислородом и тем самым ослабляющих его реакцию с субстратом (ингибиторы), либо нейтрализующих действие физических тушителей, увеличивающих концентрацию субстрата, влияющих на мембранный транспорт (прооксиданты). Наиболее вероятная схема процессов, приводящих к гибели клетки за счет ФДЭ, приведена на рис. 2.