Определение специфичности лактатдегидрогеназы
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:
| О | О | |||||||
| // | // | |||||||
| С¾ОН | + | ЛДГ | С¾ОН | + | ||||
| ½ | + НАДН | + Н | ¾¾¾¾> | ½ + | НАД | |||
| С = О | Н¾С¾ОН | |||||||
| ½ | ½ | |||||||
| СН3 | СН3 |
пируват лактат
Принцип метода. В ходе реакции кофермент НАДН + Н+ окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н+, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,22×10–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или a–кетоглутарат.
Ход работы. В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н+ и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.
Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД+ рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.
Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.
Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.
Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10–3 М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.
Флавиновые дегидрогеназы
Кофакторами для них являются флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН). Эти кофакторы являются производными рибофлавина (витамина В2).
| О | ||
| || NН2 | ||
| (ОНСН)3 ¾ CН2 ¾О ¾ (Р) | (НСОН)3 - CН2 ¾О-Р ¾ ОН ½ | |
| ½ | ½ ½ С | |
| CН2 | CН2 О / \\ | |
| ½ | ½ ½ N ¾С N | |
| СН N N | СН N N НО ¾Р=О // || ½ | |
| // \ / \ // \ | // \ / \ // \ ½ Н¾С С С¾Н | |
| Н3С ¾С С С С = О | Н3С ¾С С С С = О О \ / \ // | |
| ½ | | ½ ½ | ½ | | ½ ½ ½ N N | |
   Н3С ¾С С С N ¾Н | Н3С ¾С С С N ¾Н Н2С О | |
 \\ / \ // \ / | \\ / \ // \ / | |
  С NС | С NС Н Н | |
 ½ || | ½ || Н ½ ½ Н | |
| Н О | Н О НО ОН | |
| ФМН | ФАД |
Флавиновые кофакторы прочно связаны с апоферментом, следовательно, являются простетической группой.
В ходе реакции отщепляемые от субстрата атомы водорода присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофактора:
| Н R | Н R Н | |
| ½ ½ | ½ ½ ½ | |
| С N N | С N N | |
| // \ / \ // \ | // \ / \ / \ | |
| Н3С ¾С С С С = О | Н3С ¾С С С С = О | |
  SН2 + ½ | | ½ ½ | ½ | | ½½ ½ + S | |
| Н3С ¾С С С N ¾Н | Н3С ¾С С С N ¾Н | |
| \\ / \ // \ / | \\ / \ / \ / | |
| С N С | С NС | |
| ½ || | ½ ½ || | |
| Н О | Н Н О | |
| ФАД (или ФМН) | ФАДН2(или ФМН2) |
окисленная форма восстановленная форма
Флавиновые ферменты по типу катализируемой реакции делятся на две группы: первая группа - это ферменты, которые передают водород или электрон промежуточным соединениям, и вторая группа (оксидазы) - которые могут передавать отнятый водород кислороду воздуха.
К первой группе относятся флавопротеины: пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа Д - аминокислот (1.4.99.1), сукцинатдегидрогеназа и др.
Ко второй группе - ксантиноксидаза (1.2.3.2.), пируватоксидаза (1.2.3.3.), глюкозооксидаза и др. ферменты.