Кинетика процессов связывания молекул ксенобиотика

Адсорбция

Многие ксенобиотики действуют непосредственно на поверхность клетки, адсорбируясь на клеточной поверхности (мембране). В этой связи адсорбция играет существенную роль в познании механизмов как прямых и опосредованных мембранотропных эффектов, так и вызываемых ими реакций. Адсорбирующая поверхность в клетке может на несколько порядков превышать объем. Белки и крупные молекулы в растворе находятся в коллоидном состоянии и обеспечивают огромную поверхность для адсорбции. Так, например, площадь поверхности белков, содержащихся в 1 см³ сыворотки крови человека, составляет 100 м².

С другой стороны, физико-химические характеристики веществ после их адсорбции на мономолекулярной пленке отличаются от их свойств в растворе, что имеет большую биологическую значимость.

Когда говорят об адсорбции какого-либо вещества, подразумевают, что оно обратимо концентрируется на поверхности. Адсорбция определяется суммой всех химических связей, образующихся между молекулами или молекулами с поверхностью.

Процесс адсорбции обусловлен теми же типами связей (в особенности ван-дер-ваальсовыми, водородными и ионными), что и химические реакции, происходящие во всем объеме вещества. Ранее предполагали, что существует «химическая» и «физическая» адсорбция, однако теперь ясно, что любая адсорбция может быть только химической, т. к. все связи, возникающие при адсорбции – химические.

Поверхность обладает двумя особенностями, которые и определяют количественные различия между реакциями, протекающими на поверхности и в растворе. Во-первых, на поверхности создается 100 % концентрация вещества. Поскольку адсорбируемое вещество обладает ничтожной растворимостью (растворимое не локализовалось бы на поверхности, а распределялось бы по объему), то при такой его концентрации вероятность химического взаимодействия значительно возрастает. Так, например, на поверхности кристалла хлорида серебра концентрация равна 7 М. С другой стороны, в насыщенном растворе (1×10^–5 М) хлористого серебра практически нет.

Другая особенность поверхности заключается в том, что она содержит ненасыщенные валентности, которые в твердом веществе затрачиваются на связывание друг с другом составляющих его атомов. На рис. 6.1. приведен фрагмент кристаллической решетки углерода, поясняющей это явление.

­ ­ ­

С ¾ С ¾ С ®

½ ½

С ¾ С ¾ С ®

½ ½

С ¾ С ¾ С ®

¯ ¯ ¯

Рис. 6.1. Остаточные валентности атомов углерода на поверхности угля

Очевидно, что чем мельче истолчен кусочек угля, тем больше в нем остаточных валентностей и тем более активным адсорбентом он окажется.

На молекулу, которая адсорбируется из раствора на поверхности, действуют силы, стремящиеся возвратить ее в раствор. Мерой способности вещества возвращаться в среду является его растворимость, которую можно рассматривать как меру способности данного вещества десорбироваться.

Адсорбцию на поверхности подразделяют на неспецифическую и специфическую. Неспецифическая адсорбция характерна для веществ амфифильной природы, имеющих концевую гидрофильную группу, связанную с относительно большим гидрофобным остатком. Такие вещества занимают любую доступную им поверхность независимо от химической природы и физических свойств. В сосуде, содержащем мыльный раствор, мыло накапливается не только на поверхности раздела воздух–вода, но и на поверхности стекло–вода. Более того, мыло адсорбируется на любых предметах, погруженных в мыльный раствор. Это пример типичной неспецифической адсорбции, при которой нейтральные молекулы адсорбируются сильнее, чем ионы. Это происходит потому, что ион гидратируется сильнее, чем соответствующие неионизированные молекулы, и поэтому последние легче вытесняются из воды.

Специфическая адсорбция свойственна гидрофобным веществам, которые стремятся разместиться на поверхности, имеющей химически комплементарный характер. Простейший пример – притяжение аниона к положительно заряженному участку поверхности, а катиона – к отрицательно заряженному. В таких случаях ион будет адсорбироваться сильнее, чем неионизированная молекула.

Если при адсорбции не происходит образования ковалентных связей, то это обратимый процесс, и положение его равновесия устанавливается в соответствии с законом действующих масс. В 1918 г. Лэнгмюр вывел из этого закона уравнение, позволяющее получить количественные характеристики адсорбции.

При выводе соотношения были сделаны следующие предположения:

- энергия адсорбции постоянна и не зависит от степени заполнения поверхности;

- адсорбция происходит на локальных центрах, и адсорбированные молекулы между собой не взаимодействуют;

- максимальная возможная адсорбция соответствует полному заполнению монослоя.

Число молей вещества Г, адсорбированного на поверхности, выражается в виде функции равновесной концентрации вещества С в растворе.

С

Г = Г_max –––––– , (6.1)

К_сд + С

где К_сд – константна сорбции-десорбции; Г_max – число молей растворенного вещества, адсорбированного на поверхности адсорбента с образованием полностью заполненного монослоя; С – концентрация ксенобиотика в растворе.

Изотерму Лэнгмюра можно представить в линейной форме:

1 1 К_сд

––– = –––– + –––––– . (6.2)

Г Г_мах Г_мах С

Это уравнение показывает, что адсорбент насыщается при высоких значениях С, т. е. при образовании монослоя. Это так называемая изотерма адсорбции графически представляет собой гиперболу (рис. 6.2).

Рис. 4.2. Изотерма адсорбции Лэнгмюра

При адсорбции различных агентов часто наблюдается такое явление, когда биологический эффект от каждого последующего удвоения становится все менее ощутимым, при этом кривая зависимости эффекта от дозы также представляет собой гиперболу.

Для явлений, изучаемых общей химией, изотерма Лэнгмюра в большинстве случаев согласуется с экспериментальными данными при условии, что адсорбированный слой является мономолекулярным.

Известно несколько типов кривых, характеризующих процесс адсорбции, три из которых представлены на рис. 6.2.

1. L-кривые, нормальные изотермы Лэнгмюра, характеризующие адсорбцию молекул, ориентированных на поверхности горизонтально. Чем больше вещества адсорбировано, тем более затруднена дальнейшая адсорбция.

2. S-кривые, соответствующие вертикальной ориентации молекул относительно поверхности. На этапе, который характеризуется начальным участком сигмоидной кривой, чем больше вещества уже адсорбировано, тем легче происходит дальнейшая адсорбция. Этот эффект получил название кооперативного.

3. Н-кривые, характеризующие случаи с высокой степенью сродства; на этих кривых начальные значения концентраций адсорбированного вещества очень велики; такие кривые часто получаются, если вещество адсорбируется в виде мицелл, а также при адсорбции ионов, имеющих высокую степень сродства и способных обмениваться с ионами, обладающими малой степенью сродства.

Выделяют еще С-кривые, соответствующие линейной зависимости между константами распределения в тех случаях, когда вещество проникает в адсорбент легче, чем растворитель.

Кинетика процессов связывания молекул ксенобиотика

С мембранными центрами

Ряд ксенобиотиков вызывает биологическую реакцию, взаимодействуя с определенными местами связывания на мембране. Анализ развития мембранотропных эффектов должен опираться на совокупность модельных представлений, отражающих течение двух основных этапов: связывание молекул эффектора с некими центрами сродства (рецептор), инициирующими процесс, и последующее развитие реакции (биологический ответ).

При рассмотрении взаимодействия химического агента с биологическими мембранами объектами анализа оказываются процессы доступа эффектора к мембраноактивным центрам, сам акт их взаимодействия и последующее развитие реакции (биологический ответ).

Обычно для анализа кинетических зависимостей в токсикологии и фармакологии используются соотношения, соответствующие случаю отсутствия диффузионных ограничений, т. е. процессы диффузии полагаются быстрыми в сравнении с развитием реакции.

В простейшем случае, предполагая, что образование комплекса лиганд (ксенобиотик)/мембраноактивный центр происходит при отсутствии диффузионных ограничений со стехиометрией 1:1 и независимости мест связывания друг от друга (образование комплекса с одним из мембраноактивных центров не влияет на взаимодействие остальных активных центров с молекулами лиганда), реакция связывания лиганда А с активным сайтом (рецептор) R запишется в виде:

k

R + A RA, (6.3)

k'

где k, k' – константы скоростей прямой и обратной реакции соответственно.

Полагая общую концентрацию мест связывания – рецепторов (занятых и незанятых) в данной системе, равной Q, при концентрации эффектора С, имеем следующее равенство для скорости изменения концентрации Z-комплексов лиганд-рецептор во времени в условиях избытка лиганда (С >> Q):

dZ

––– = k (Q – Z)C – k'Z. (6.4)

dt

В равновесии dZ/dt = 0 и

QC

Z^равн = ––––– . (6.5)

K + C

Следовательно, когда процессы диффузии оказываются быстрыми в сравнении с развитием биологической реакции, образование комплексов опишется уравнением

QC

Z(t) = –––––– [1 – e^{- (k'-kC) t}], (6.6)

K + C

а процесс разрушения комплексов –

Z(t) = Z₀e^{-k' t}, (6.7)

где k и k' – прямая и обратная константы скоростей образования комплекса Z; Q – концентрация мембраноактивных центров; С – концентрация эффектора.

Кривые, описываемые этими уравнениями, изображены на рис. 6.3.

Рис. 6.3. Концентрационная зависимость связывания эффектора с мембраноактивным центром (1) и диссоциация комплекса при удалении эффектора (2). Стрелкой ( ↑ ) указан момент удаления лиганда

Отношение констант k’/ k = К называется константой равновесия комплекса. Она равна концентрации эффектора, вызывающей половинное насыщение мест связывания. В самом деле, если С = К, то, как следует из уравнения (6.5),

QК

Z = ––––– = Q/2. (6.8)

K + К

Скорость образования комплексов во времени будет тем большей, чем выше концентрация эффектора (6.6). Скорость же распада от нее не зависит (6.7).

Мы рассмотрели простейший случай локализации рецепторов прямо на поверхности мембраны. Но часто кривая развития процесса имеет S-образную форму (рис. 6.4). В этом случае для интерпретации наблюдаемых зависимостей используется ряд подходов.

Рис. 6.4. Концентрационная зависимость связывания эффектора с мембраноактивными центрами

Один из них – это модель «биофазы». «Биофаза» – располагающийся внутри мембраны компартмент, содержащий рецепторы и находящейся в контакте со средой. Описание процесса проводят на базе балансовых уравнений (так, как это принято в фармакологии и токсикологии). В этом случае можно записать систему дифференциальных уравнений, характеризующих динамику перемещений эффектора в компартмент при стехиометрии 1: 1следующим образом:

Рис. 6.5. Схема процесса взаимодействия эффектора с рецепторными структурами (модель «биофазы»)

d`с

–––– = k₁С(B – `с) – k<sub>1</sub>´`с – k₂´`с(Q – Z) + k₂´Z – k₃ с

dt

dZ

–––– = k₂ с (Q – Z) – k₂´Z, (6.9)

dt

где `с – концентрация эффектора в биофазе; B – предельная емкость биофазы; k_i, k_i´ – константы скоростей реакций, смысл которых ясен из рис. 4.5.

Стационарная величина количества образовавшихся комплексов окажется равной

QСB/ (B+К₁)

Z = ––––––––––––––––––––––, (6.10)

С + (K₂ + К₂/К₁)( B+К₁)

где К₁ = k₁´/k₁ – коэффициент распределения эффектора между биофазой и средой, содержащей эффектор в концентрации С; К₂ = k₂´/k₂ – константа диссоциации комплекса.

При очень малых концентрациях эффектора С и сравнительно небольших значениях К₁ и К₂ можно предположить Q > Z, B > C и система (4.9) упрощается:

d`с

–––– = k₁СB – a`с – k<sub>2</sub>Q `с + k₂´Z,

dt

(6.11)

dZ

––– = k₂ Q`с – k₂Z,

dt

где a = k₁С + k₁´ + k_3.

Процесс отмыва связанного эффектора после перенесения тестового объекта в контрольный раствор описывается уравнением

b₂ b₁

Z = Z_о (———e^-b1t – ———e^-b2t), (6.12)

b₂ – b₁ b₂ – b₁

где b₁ = [k₂´ + a + k₂Q – ( k₂´ + a + k₂Q)² + 4a k₂´]/2,

b₁ = [k₂´ + a + k₂Q + ( k₂´ + a + k₂Q)² + 4a k₂´]/2. (6.13)

Решения с различными приближениями приводят к описаниям кривых, характеризующихся наличием лаг-фазы (см. рис. 6.4). Аналогичный результат дает также численное интегрирование системы (6.9).

Рассмотренные выше примеры предполагают связывание с одним рецептором одной молекулы лиганда. В принципе можно допустить существование комплексов лиганд-рецептор RA_n с любыми стехиометрическими коэффициентами. Могут, например, существовать многовалентные места (рецепторы), образующие комплексы RA_n путем последовательного присоединения лигандов:

R +A = RA₁,

RA₁ + A = RA₂, (6.14)

. . . . . .

RA_n-1 +А = RA_n.

Если присоединение каждой последующей молекулы лиганда не зависит от количества ранее связанных с активным центром (рецептором) молекул, то данный процесс подчиняется уравнениям (6.4) и (6.5). В противном случае имеют место эффекты, обычно называемые кооперативными (например, связывание каждым рецептором двух молекул), причем кооперативность бывает отрицательной и положительной.

Когда присоединение каждой последующей молекулы облегчается вследствие посадки предыдущей, то говорят о положительной кооперативности, если, наоборот, затрудняется, – имеем отрицательную кооперативность.

Положительную кооперативность можно продемонстрировать на примере связывания кислорода молекулой гемоглобина, которая состоит из четырех субъединиц: двух a- и двух b-цепей. Каждая из субъединиц может связывать одну молекулу кислорода. Оказалось, что сродство к кислороду отдельного центра связывания (гема) тем выше, чем больше других центров связывания уже занято молекулами кислорода.

Существует несколько характерных приемов установления признаков кооперативности. Препарат рецепторов, насыщенный радиоактивным лигандом, можно перенести в среду, не содержащую его, и измерить скорость диссоциации «меченых» комплексов. При этом часть препарата помещается в раствор, содержащий высокую концентрацию немеченого лиганда, часть – в раствор без лиганда. Если в первом случае скорость распада комплекса выше, это может свидетельствовать о наличии отрицательной кооперативности: нерадиоактивный лиганд, связываясь со свободными, незанятыми радиоактивными рецепторами, ослабляет меченые комплексы. И наоборот, если в присутствии нерадиоактивного лиганда скорость диссоциации снижается, говорят о проявлении положительной кооперативности.

Можно рассчитать константы скорости связывания лиганда препаратом рецепторов при высоких и низких концентрациях; если они окажутся различными, это также можно рассматривать как признак кооперативности – положительной или отрицательной, в зависимости от того, в каком именно случае эта величина окажется больше.

Но самый популярный среди исследователей способ выявления кооперативности – это анализ характера отличий концентрационной зависимости количества связывающегося лиганда от классического уравнения (6.5). Представляя полученные данные в скэтчардовских координатах (рис. 6.6), при вогнутой кривой говорят об отрицательной кооперативности, при выпуклой – о положительной.

Рис.6.6. Скэтчардовские графики связывания эффектора с мембраноактивными центрами: отрицательная (1) и положительная (2) кооперативность

Предельному случаю сильно выраженной положительной кооперативности (n>1) соответствует популярное уравнение Хилла. Здесь речь идет о механизме, допускающем лишь одновременное присоединение всех молекул эффектора к рецептору без образования промежуточных комплексов RA₁, RA₂ … RA_n:

k

R + nA RA_n ,

k´

dZ

–––– = k (Q – Z)C ⁿ – k´Z , (6.15)

dt

QC ⁿ

Z^равн (C) = ––––

K + C ⁿ

Соотношение, описывающее образование комплексов, имеет вид:

QC ⁿ

Z (t) = –––––– [1 – e ^{(-k’+kCn) t}], (6.16)

K + C ⁿ

а диссоциация комплексов при отмыве:

Z(t) = Z_oe^-k’t . (6.17)

Следует отметить, что чем больше величина n, тем сильнее выражен S-образный характер кривой.