Принято называть пептидной связью

Химизм реакции: при добавлении сернокислой меди в сильно основной раствор белка образуются комплексные соединения меди, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавить 3 капли 10%-ного раствора едкого натра и 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди, смешать - появляется сине-фиоле­товое окрашивание.

2. Нингидриновая реакция выявляет a-аминогруппы: растворы белка, a-амино­­­ки­с­­лоты и пептиды при нагревании с нингидрином приобретают фиолетовое окрашивание.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавить 5 капель 0,1%-ного раствора нингидрина, кипятить 1-2 мин - появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.

3. Ксантопротеиновая реакцияоткрывает в белках циклические аминокислоты, основой структуры которых является бензольное ядро. Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой приобретает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании.

Химизм: реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца соответствующих аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета:

Ход работы. К 5 каплям раствора белка добавить 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятить. Появляющийся осадок белка окрашивается в желтый цвет. После охлаждения прилить по каплям 10%-ный раствор едкого натра до появления оранжевого окрашивания.

4. Реакция Миллонаоткрывает в белках циклическую аминокислоту тирозин, имеющую фенольную группировку, которая, взаимодействуя с реактивом Миллона (смесь азотнокислых солей закиси и окиси ртути в концентрированной азотной кислоте), образует ртутную соль красного цвета. Белки, не содержащие тирозина, этой реакцией не обнаруживаются. При избытке реактива Миллона появление окраски (красного цвета) может быть замаскировано ксантопротеиновой реакцией за счет азотной кислоты.

Ход работы. К 5 каплям раствора белка прилить 3 капли реактива Миллона - появляется осадок белка, который при осторожном нагревании окрашивается в кирпично-красный цвет. Ту же процедуру, повторить с раствором фенола (осторожно — ожоги!).

6. Реакция Фоля позволяет обнаружить в белке аминокислоты (цистин и цистеин), содержащие непрочно связанную серу.

Химизм реакции: при кипячении белка со щелочью цистин и цистеин теряют серу в виде сероводорода, который с плюмбитом образует черный или серый осадок сернистого свинца (реактив Фоля состоит из 5%-ного раствора уксуснокислого свинца и избытка 10%-ного раствора едкого натра):

1) а) (CH₃COO)₂Pb+2NaOH → 2CH₃COONa+ ↓ РЬ(ОН)₂+NаОН;

б) Pb(OH)₂+2NaOH → NaPbO₂+2Н₂O+избыток NaOH;

СН - SH СН₂ОН

│ │

2) CH - NH₂+2NаОН → СН – NН₂+Nа₂S+Н₂О;

│ │

СООН COOH

Цистеин Серин

3) Nа₂S+Nа₂РЬО₂+2Н₂О → PbS ↓ +4NaOH.

Черный

осадок

Ход работы. К 5 каплям раствора белка прилить 5 капель реактива Фоля, нагреть до кипения и оставить на 1 или 2 мин - появляется бурый или черный осадок сернистого свинца.

ВНИМАНИЕ!!!

После выполнения проб каждому студенту необходимо индивидуально проделать следующее: в пробе жидкости, полученной у ассистента, установить наличие белка или аминокислот (при обнаружении аминокислот определить тип).

Дайте (письменно) обоснованные ответы на следующие вопросы:

1. Из 1 мл биологической жидкости полностью осажден белок, с помощью метода Къельдаля в осадке обнаружено 3 мг азота.

Каково процент­ное содержание белка в исследуемой жидкости?

2. Исследуемая биологическая жидкость при нагревании с нингидрином приобретает фиолетовое окрашивание. Содержатся ли в исследуемой жидкости соединения белковой природы?

3. Исследуемая жидкость при нагревании с реактивом Миллона приобретает кирпично-красный цвет.

Свидетельствует ли это о присутствии белка?

4. Реакция Фоля с биологической жидкостью положительна.

Ваши выводы, нужна ли дополнительная информация?

5. Можно ли установить присутствие свободных аминокислот в растворе белка, располагая реактивами только для нингидриновой пробы?

Используя учебник, проделайте следующее:

1. Запишите определение понятия «белковая молекула»,

2. Изобразите структурные формулы протеиногенных аминокислот,

3. Разделите их в зависимости от строения радикала на циклические и ациклические,

4. Разделите их в зависимости от характера дополнительной функциональной группы.

ЗАНЯТИЕ 2 («Хроматографическое разделение аминокислот. Высаливание белков. Количественное определение белков»)

Цель занятия: 1) ознакомиться с физико-химическими свойствами белков (мо­­лекулярная масса, растворимость, электролитические свойства, денатурация, амфотерность), с видами связи аминокислот в белковой молекуле, со строением полипептидной цепи, её пространственной структурой и химическими связями, поддерживающими пространственную конфигурацию, с клас­си­фикацией белков, с важнейшими представителями простых белков; 2) выполнить лабораторную работу по осаждению белков высаливанием, определить количество белка в исследуемой жидкости; 3) познакомиться с простейшим приёмом хроматографического разделения аминокислот.

Студент должен знать следующее:

1. Почему для определения молекулярной массы /ММ/ белков неприемлемы эбулиоскопический и криоскопический методы.

2. Принципы осмометрического и диффузионного методов, принцип метода ультрацентрифугирования.

3. Принцип и технические приёмы гель-фильтрации.

4. Чем обусловлена растворимость белка в воде, какие факторы или воздействия её изменяют, содержание термина «высаливание», в каких целях используется высаливание.

5. Понятия «нативный» и «денатурированный» белок, виды денатурирующих воздействий; изменения, происходящие при денатурации, а также разницу между коагуляцией (осаждением) и денатурацией.

6. От чего зависит заряд белковой молекулы, значение понятий «изоэлектрическая точка» и «изоэлектрическое состояние».

7. Принцип разделения аминокислот хроматографическими методами.

8. Принципы классификации соединений белковой природы в зависимости от состава (наличие или отсутствия компонентов, не являющихся аминокислотами).

9. Классификацию простых белков (протеинов), в частности, простых белков животного организма

Студент должен уметь:

1. Различать по данным о качественном составе белковой молекулы простые и сложные белки.

2. Различать на основании данных об аминокислотном составе и о молекулярной массе /ММ/ протеины и полипептиды.

3. Рассчитать ММ простого белка по его аминокислотному составу.

4. Ориентировочно (на уровне «растворим» или «плохо растворим») про­гнозировать растворимость белка в воде по данным об его аминокислотном составе.

Студент должен получить представление:

1. О принципах определения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации и ультрацентрифугирования,

2. Об использовании в медицинской практике свойства белков осаж­даться тяжелыми металлами,

3. О том, как используют данные об электрофоретической подвижности белков в диагностических целях,

4. О значении данных об аминокислотном составе пищевых белков как критерия полноценности рационов питания.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1) расчет ММ по структурной формуле соединения,

2) сведения о «гидратной» воде,

3) сведения об осмотическом давлении, его связи с ионным составом и концентрацией ионов,

4) сведения о реакциях гидролиза,

5) понятие о началах термодинамики,

6) сведения о принципе и технике колориметрии и нефелометрии.

Аудиторная работа

Лабораторная работа (Хроматографическое разделение аминокислот - демонстрация прибора и хроматограммы. Высаливание белков, их количественное определение)

1. Высаливание белков сыворотки крови сульфатом аммония может использоваться для разделения альбуминов и глобулинов, так как глобулины осаждаются при 50%-ном насыщении сульфатом аммония, а альбумины - при 100%-ном насыщении.

Ход работы. В пробирку внести 2 мл сыворотки крови и прибавить столько же насыщенного раствора сульфата аммония. Образующийся осадок отфильтровать - на фильтре при этом останутся глобулины. К фильтрату добавить сухого тонко измельченного порошка сульфата аммония до насыщения. Образующийся при этом осадок, представленный альбуминами, отделить фильтрованием.

Высаливание сульфатом аммония обратимо. В этом можно убедиться, поместив фильтры с осадком белка в воду - происходит растворение осадка.

2. Количественное определение белка в моче основано на реакции осаждения белка сульфосалициловой кислотой и определении мутности осадка (нефелометрическое определение).

Ход работы:

А. Опытная проба - 1) в центрифужную пробирку внести 1.25 мл фильтрата мочи и добавить до 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты; 2) экспонировать 5 мин; 3) внести пробу после экспозиции в кювету (10 мм) фото­электроколориметра и определить (против воды) плотность образовавшейся мути, используя оранжевый фильтр.

Б. Контрольная проба: внести в центрифужную пробирку вместо сульфосалициловой кислоты 1,25 мл дистиллированной воды и далее воспроизвести пункты 2- и 3 основного опыта.

Найти разницу между оптической плотностью опытной и контрольной проб и учесть результат по калибровочному графику.

Представленный график (см. следующую страницу) построен по результатам определения оптической плотности растворов альбумина с известной концентрацией при добавлении к ним сульфосалициловой кислоты: на оси абсцисс отложены значения концентраций белка (в %), на оси ординат – значения оптической плотности (единица измерений - экстинкции).

0.4

0.20

0.12

0.04

0.1 0.25 0.50 1.0 С, %