Физико-химические свойства белков

1. Растворимость. Белки формируют коллоидные растворы, что обусловлено размером частиц (размеры частиц 0,1-0,001 мкм). Для растворов белков характерны следующие характеристики: низкое осмотическое давление, высокая вязкость, низкая способность к диффузии. В лабораторной практике используют 2 свойства коллоидных растворов белков: нефелометрическое определение количества белка на основе эффекта Тиндаля; диализ – очистка белков от низкомолекулярных примесей.

2. Амфотерность белков. Белки обладают кислыми и основными свойствами из-за присутствия карбоксильных и аминогрупп. Изоэлектрическая точка белков (pI) – значение рН, при котором суммарный заряд белка равен нулю. В pI белок электронейтрален с минимальной растворимостью, максимальной преципитацией и наименьшей буферной способностью. Изоэлектрическая точка определяется количеством NH₂ и СООН групп в молекуле белка. Если количество NH₂ и СООН групп равны, рI лежит в слабокислой среде (ионизация карбоксильных групп несколько выше, чем аминных) при рН≤7. Если количество NH₂>СООН, то pI лежит в щелочной среде. Если количество NH₂<СООН, то pI лежит в кислой среде. При рН>pI заряд белка всегда отрицательный, так как карбоксильные группы переходят в форму СОО^-, а аминные группы в форму NH₂. При рН<рI заряд белка положительный, т.к. при уменьшении рН все больше аминогрупп переходит в форму NH₃⁺, а диссоциация карбоксильных групп подавляется.

3. Способность к осаждению (преципитации). Существуют два фактора устойчивости белков в коллоидном растворе: заряд и гидратная оболочка. Белки могут быть преципитированы путем дегидратации и/или нейтрализации полярных групп.

Преципитация в рI. Белки мало растворимы в изоэлектрической точке. Например, белок молока казеин сворачивается, если молоко кислое. Это объясняется тем, что молочная кислота, образуемая бактериями, снижает рН, приближая его к изоэлектрической точке казеина (pI= 4,6).

Высаливание. Процесс преципитации добавлением нейтральных солей (сульфата аммония или сульфата натрия) называется высаливанием. Этот процесс объясняется дегидратацией молекул белков солями, что приводит к молекулярной агрегации и преципитации. Количество соли, необходимой для преципитации, зависит от молекулярной массы белка. Чем больше молекулярная масса белка, тем меньше соли необходимо для преципитации. Например, глобулины сыворотке осаждаются полунасыщенным раствором сульфата аммония, в то время как альбумин – насыщенным раствором. Высаливание используется для разделения белков сыворотки крови.

Добавление незначительного количества нейтральных солей повышает растворимость белков.

Осаждение солями тяжелых металлов. Ионы тяжелых металлов (Pb²⁺, Hg²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺) вызывают осаждение белков. Металлы имеют положительный заряд и в щелочной среде вызывают преципитацию белков.

Осаждение анионами или алкалоидными реактивами. Белки осаждаются трихлоруксусной кислотой, сульфосалициловой кислотой, пикриновой кислотой, таниновой кислотой. Белки являются катионами и добавление анионов кислот приводит к образованию комплексов белок-анион.

4. Электрофорез белков. В методе электрофореза белков сыворотки используют слабощелочные буферные растворы (т.е. рН>pI), чаще рН 8,6. При этом белки заряжаются отрицательно и перемещаются к аноду. Подвижность заряженной молекулы в электрическом поле называют электрофоретической подвижностью μ. Этотпоказательдля сферической молекулы рассчитывают μ=Q/6πηr×V, где Q – суммарный заряд молекулы, r – радиус молекулы, η – вязкость жидкой среды, в которой движется заряженная частица, V – приложенное напряжение. Принято, что в среде с постоянной вязкостью и напряжением движение заряженной частицы определяется величиной отношения заряда к радиусу частицы. С увеличением этого отношения подвижность частиц растет. Если частицы близки по радиусу, то их электрофоретическая подвижность будет пропорциональна заряду. Величина μ растет с повышением значения Q.

Изоэлектрическое фокусирование. Метод основан на том, что в изоэлектрической точке белок теряет заряд и теряет подвижность в электрическом поле. Трубку с гелем заполняют амфолинами, создающими градиент рН. В электрическом поле белок будет передвигаться до того значения, где он войдет в свое изоэлектрическое состояние и, потеряв заряд, остановится.

Наибольшее распространение и развитие получил метод электрофореза в полиакриламидном геле.

Наибольшие успехи в изучении заряженных молекул получены с помощью метода электрофореза. В этом методе заряженные частицы распределяются в электрическом поле в зависимости от заряда. Электрофорез может производиться в буферном растворе с регистрацией границы между фракцией белка и буферным раствором (капиллярный электрофорез) или на носителях. Для изучения белков чаще используют электрофорез в полиакриламидном геле (рисунок.2.4).

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) обладает высокой разрешающей способностью, а именно, используя краситель Кумасси голубой, можно выявить 0,1 мкг (~2 пмоль) белка, а при серебрении – чувствительность повышается в 5 раз (выявление 0,02 мкг белка). При доступной технике SDS-PAGE удается разделить белки, отличающиеся только на 2% по молекулярной массе (например, белки с молекулярными массами 40 и 41 кДа, имеющие различие только по 10 аминокислотным остаткам полипептидных цепей).

Изоэлектрическое фокусирование позволяет разделить белки, отличающиеся по изоэлектрической точке только на 0,01. Комбинация изоэлектрического фокусирования с SDS-PAGE дает весьма чувствительный метод разделения белков - двумерный электрофорез (Two-Dimensional Electrophoresis). Этот способ разделения белков использовался при рождении протеомики. По этому способу 1) производят в горизонтальном направлении разделение белков методом изоэлектрического фокусирования (по рI), а затем 2) в вертикальном направлении производят двумерный электрофорез разделившихся белков методом SDS-PAGE (по молекулярной массе).