Микрофлора воды. Оценка санитарного состояния воды. Методы определения микробного числа воды и выявление колиформных бактерий. Нормативы
В пресных водоёмах (реки, озёра) нормальными обитателями являются Micrococcus roseus и др. микрококки, Pseudomonas fluorescens, извитые формы (Sp. rubrum). В воду поступают сапрофитные микробы почвы: p. Azotobacter, p. Nitrobacter, p. Proteus, p. Pseudomonas, p. Spirillum и др. Микробы воды участвуют в самоочищении водоемов. Они расщепляют органические вещества и делают их пригодными для усвоения другими организмами. Они являются также пищей для раков и моллюсков. Больше всего микроорганизмов находится в придонных слоях, на дне, в прибрежной зоне (осенью и весной), т.к. на твердых частицах, в пористых материалах задерживаются питательные вещества. Таким образом, вода может быть фактором передачи инфекционных заболеваний (брюшного тифа и паратифа, дизентерии, сальмонеллёза, холеры, лептоспироза, полиомиелита, гепатита, туляремии).
Критерии санитарного состояния воды.
1. ОБЩАЯ МИКРОБНАЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ ВОДЫ.
2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ВОДЫ. Санитарно-показательными микроорганизмами воды являются:
а) E. coli, Str. faecalis (свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении);
б) p. Citrobacter, p. Enterobacter (свидетельствуют о сравнительно давнем фекальном загрязнении).
Для оценки санитарного состояния исследуют: 1) водопроводную воду; 2) дистиллированную воду; 3) воду открытых водоемов.
Определение ОМЧ водопроводной воды: а) берут не менее 500 мл воды с соблюдением асептики (обжигают краны, используют стерильную посуду); б) делают посев 10-кратных разведений воды (1:10, 1:100 и т.д.) в чашки Петри по 1 мл глубинным методом Коха на МПА (для бактерий) и на сусло-агар (для грибов); в) инкубируют при 37°С, 24 час для бактерий и при 24°С, 2-3 суток для грибов; г) считают число колоний (1 колония – 1 клетка); г) число колоний (1 колония=1 клетка) умножают на степень разведения и получают микробное число воды (т.к. объем посева - 1 мл, а ОМЧ воды – число микроорганизмов в 1 мл воды).
Определение микробного числа дистиллированной воды. 300 мл воды отбирают в стерильные бутылки из бюретки, которую обжигают ваткой, смоченной спиртом. Бутылки закрывают ватными пробками и бумажными колпачками. Дистиллированную воду для приготовления инъекционных растворов, отбирают в стерильные флаконы по 15-20 мл из ёмкостей, в которых проводится стерилизация. Посев и расчет производят так же, как и при исследовании водопроводной воды.
Определение микробного числа речной воды. 100 мл воды берут при помощи батометра с определенной глубины. Делают посевы 1,0; 0,1 и 0,001 мл так же, как и при исследовании водопроводной воды.
Определение коли-титра и коли-индекса. Разработаны стандарты определения этих показателей для водопроводной воды и воды артезианских скважин. Для воды открытых водоемов стандарты не разработаны и для ее анализа используют разные методы в зависимости от загрязнения воды.
Для определения коли-титра воды чаще используют двухфазный бродильный метод.
Первый этап– делают посев на среду Эйкмана (глюкозопептонная среда – ГПС) с поплавками для сбора газа и посевы ставят в термостат (инкубируют) при 43°C на 24 часа. Концентрированную среду Эйкмана используют для анализа водопроводной воды. Делают посев двух проб воды по 100 мл в колбы с 10 мл среды и десяти проб по 10 мл воды в пробирки с 1 мл среды. Таким образом, объем засеянной воды – 300 мл: 2 колбы по 100 мл и 10 пробирок по 10 мл.
Второй этап– делают пересевы на среду Эндо и РДА (розолово-дифференциальный агар) из тех колб и пробирок, где наблюдается рост. Признаки роста E. coli на среде Эйкмана - диффузное помутнение и образование газа. Посевы инкубируют при 37°C 24 часа.
Третий этап – просматривают посевы на среде Эндо и РДА. Признаки роста E. coli на среде Эндо - образование гладких колоний красного цвета, с металлическим блеском. Признаки роста E. coli на РДА - пожелтение среды, вспенивание конденсационной жидкости и разрывы в РДА.
Проводят микроскопическое подтверждение E. coli: из подозрительных колоний делают мазки и окрашивают по Граму; под микроскопом наблюдают грам «-» мелкие палочки.
Проводят биохимическое подтверждение E. coli - оксидазный тест на цитохромоксидазу. Если есть цитохромоксидаза - бумажка синеет в течение 1 минуты. E. coli - оксидазоотрицательная.
Для определения коли-индекса воды используют метод мембранных фильтров.
1. Воду пропускают через мембранный фильтр №3. Мембранные фильтры перед фильтрованием стерилизуют кипячением в дистиллированной воде.
Воду из водопроводной системы Москвы и Санкт-Петербурга и воду артезианских скважин фильтруют в объёме 500 мл, воду других городов – в объёме 333 мл.
2. Фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри.
3. Инкубируют при 37° C в течение суток и подсчитывают количество выросших колоний, типичных для E. coli.
4. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму, а также ставят оксидазный тест. Если в мазках видны грам «-» мелкие палочки, которые являются оксидазоотрицательными, то результат считается положительным.
5. 2-3 такие колонии засевают в разведённую среду Эйкмана и инкубируют в течение суток при 37° C. Если в пробирках имеется газообразование, дают окончательный положительный ответ на наличие E. coli.
Коли – индекс рассчитывают по количеству красных колоний на фильтре. Например, на фильтре выросли 3 окрашенные колонии, а воды было 300 мл. Следовательно, в 100 мл – 1 клетка E. coli, а в 1000 мл – 10 клеток, т.е. коли-индекс равен 10. Исходя из этого значения коли-индекса, рассчитываем коли-титр: 1000/10 = 100. Если коли-индекс равен 5, то коли-титр равен 1000/5=200.
Микробное число водопроводной воды не должно превышать 50, а дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарств, не должно превышать 10-15.
Микрофлора воздуха. Оценка санитарного состояния воздуха закрытых помещений. Методы определения микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов. Расчет омелянского.
В воздухе могут встречаться до 100 видов сапрофитных микроорганизмов: пигментообразующие бактерии (микрококки, жёлтая сарцина, палочка чудесной крови и др.), спорообразующие микробы (дрожжи, плесневые грибы, актиномицеты), споровые палочки (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus), которые наиболее устойчивы к действию прямого солнечного света и высушивания.
В связи с этим воздух может быть фактором передачи ряда инфекций: гриппа, кори, скарлатины, дифтерии, туберкулёза, коклюша, стрептококковых, стафилококковых и менингококковых инфекций, ангины, оспы, лёгочная форма чумы и др.
Критерии оценки санитарного состояния воздуха закрытых помещений.
1. ОБЩАЯ МИКРОБНАЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ.
2. КОЛИЧЕСТВО САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРОБОВ ВОЗДУХА.
Cанитарно-показательными микробами воздуха закрытых помещений являются:
1) золотистый стафилококк - S. aureus;
2) a-зеленящий стрептококк - Str. viridans;
3) b-гемолитический стрептококк - Str. haemolyticus.
1. Седиментационный метод Коха - наиболее простой метод. Он используется только для ориентировочного анализа. Посев воздуха делают так: чашку Петри с определенной плотной питательной средой оставляют открытой в течение определённого времени и микробы оседают из воздуха на поверхность среды. Затем чашки Петри с посевом инкубируют в термостате и подсчитывают число колоний, зная, что 1 колония – 1 клетка. Микробное число воздуха или количество санитарно-показательных микробов подсчитывают, пользуясь правилом Омелянского: на поверхность питательной среды площадью 100 см2 за 5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.
2. Аспирационный метод Кротова - более точный количественный метод. Посев воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова. Прибор Кротова устроен так, что можно сделать посев определенного объема воздуха на различные среды.
Для определения общего количества сапрофитных бактерий пропускают 100 л воздуха и используют МПА.
Для определения количества санитарно-показательных микробов пропускают 250 л и используют желточно-солевой агар для стафилококка, среду Гарро (кровяной агар с генциановым фиолетовым) для стрептококков.
В каждом помещении делают посевы на 5-10 чашек Петри. Посевы на МПА, среде Гарро и желточно-солевом агаре инкубируют при 37°С, 24 часа, а затем выдерживают при комнатной температуре 24 часа. Посевы на среде Сабуро – при 22-28°С, 4 сут. После инкубации подсчитывают количество колоний и производят пересчет на 1 м3 воздуха. Идентификацию стафилококка, выросшего на желточно-солевом агаре, проводят по специальным тестам.