Занятие 5 (Влияние температуры и реакции среды на каталитическую активность ферментов. Специфичность ферментов)

Цель занятия: изучить свойства ферментов, обусловленные их белковой природой.

Студент должен знать:

1. Прямые и косвенные доказательства белковой природы ферментов а также то, что ферменты могут иметь структуру простых и сложных белков.

2. Соединения, выполняющие функцию простетической группы ферментов.

3. Принципы классификации ферментов, современную классификацию и номенклатуру.

4. Свойства ферментов и факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

5. Как регистрируется активность фермента. Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

6. Что представляет собой активный и каталитический центры фермента

7. Способы выражения активности ферментов.

Студент должен уметь:

1. Расшифровать функцию фермента по его химическому наименованию.

2. Назвать субстрат фермента по химическому наименованию.

3. Рассчитать активность фермента по данным, полученным в экспериментальной системе, в которой после внесения исследуемого фермента через определенное время установили количество превращенного субстрата.

4. Распознать среди перечня химических соединений те из них, которые могут играть роль коферментов.

5. Определять температурный и рН-оптимум фермента.

6.. Строить графики зависимости скорости реакции от температуры, рН среды и концентрации субстрата, находить константу Михаэлиса.

Студент должен получить представление:

1) о существовании заболеваний, обусловленных наследуемыми дефектами генов, ответственных за продукцию белков-ферментов,

2) о возможностях, которые предоставляет энзимология практической медицине,

3) о лечебном применении энзимов в диагностике и терапии (энзимодиагностике и энзимотерапии),

4) о принципах хранения ферментативных препаратов

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1) сведения о связи структуры и функции в молекуле белка;

2) сведения о факторах, стабилизирующих белковую молекулу, и факторах, повышающих лабильность белковой молекулы,

3) сведения о влиянии температуры и рН среды на диссоциацию.

Аудиторная работа.

Лабораторные работы

1. Влияние температуры на каталитическую активность амилазы слюны.Амилаза слюны катализирует расщепление крахмала через стадию образования декстринов до дисахарида мальтозы, которая обладает восстанавливающими свойствами. О действии фермента можно судить по исчезновению субстрата амилазы (крахмала) или по образованию конечных продуктов расщепления.

Крахмал обнаруживается пробой Люголя (синее окрашивание со свободным йодом). Мальтоза открывается реакцией Троммера (при нагревании с восстанавливающим сахаром гидрат окиси меди восстанавливается сначала в гидрат закиси желтого цвета, затем - в закись меди кирпично-красного цвета).

Ход работы. В четыре пробирки отмерить по 4 мл 0,5%-ного раствора крахмала и по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз водой. 1-ю пробирку поместить в кипящую водяную баню, 2-ю - в ледяную баню, 3-ю - в термостат при 37⁰ С, 4-ю - оставить при комнатной температуре. Через 10 мин содержимое каждой пробирки разделить на две примерно равных части.

С одной частью провести пробу на крахмал, с другой - на восстанавливающий сахар (пробы Люголя и Троммера соответственно):

1) к содержимому пробирки добавить 2 капли раствора Люголя – появление синего окрашивания свидетельствует о наличии крахмала;

2) к содержимому пробирки добавить 1 мл 10%-ного раствора едкого калия и по каплям вносить 1%-ный раствор сернокислой меди до образования неисчезающего осадка (муть на фоне голубой окраски раствора); затем нагреть до кипения - появление желтого окрашивания, переходящего в кирпично-красное, указывает на наличие восстанавливающих углеводов.

Сравнить результаты проб, проведенных при разных температурах, и сделать выводы.

2. Влияние рН на действие ферментов.Зависимость активности ферментов от концентрации Н-ионов можно проследить в опытах с амилазой слюны, рН-оптимум которой равен 6,8.

Ход работы. В три пробирки внести по 3 мл буферного раствора с рН 1,2; 6,8 и 10,0. Добавить в каждую пробирку по 1 мл слюны, разведенной водой в 10 раз, и по 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала. Смешать и инкубировать при 37⁰С 10 мин. Подкислить содержимое второй и третьей пробирок добавлением соответственно 1 и 2 мл 0,1 н соляной кислоты (реакция на крахмал положительна только в кислой среде!) и провести пробу Люголя. Сравнить интенсивность распада крахмала в зависимости от рН и сделать выводы.

3. Специфичность действия ферментов.Специфическими субстратами амилазы слюны являются крахмал и гликоген, расщепление которых амилаза катализирует. Образующаяся при расщеплении крахмала мальтоза обнаруживается пробой Троммера.

Используя в качестве субстрата сахарозу, можно убедиться в том, что амилаза не катализирует распад крахмала.

Ход работы. В одну пробирку внести 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала, в другую -.2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Добавить в обе пробирки по 2 мл слюны, разведенной в 10 раз водой, смешать и оставить на 10 мин при 37⁰С.

Провести с содержимым обеих пробирок пробу Троммера. Она окажется положительной при наличии редуцирующего углевода - мальтозы (пробирка первая) и отрицательной в отсутствие редуцирующего углевода (пробирка вторая).

Решите следующие задачи, приведите ход рассуждений:

1. Как доказать, что способность дрожжевых клеток расщеплять крах­мал сохраняется и при их разрушении?

Вы располагаете раствором крахмала, раст­вором Люголя, поваренной солью и льдом.

2. Как обнаружить присутствие каталазы в биологической жидкости?

3. Какой раствор можно использовать для обнаружения примеси свежей крови в воде: разбавленным этанолом, муравьиной кислотой, перекисью водорода, раствором хлорида калия?

4. Выберите правильное утверждение:

а) катализатор ускоряет реакцию, не участвуя в ней;

б) катализатор ускоряет реакцию, образуя промежуточные соединения с исходными продуктами, и входит в состав конечных продуктов;

в) катализатор ускоряет реакцию, взаимодействуя с реагирующими соединениями, но не входит в состав конечных продуктов;

г) катализатор ускоряет реакцию, но не входит в состав конечных продуктов.

5. Вещества А и Б взаимодействуют по схеме А+Б↔АБ. При заданной концентрации Аи Б через 30 мин после их смешивания устанавливается подвижное равновесие - скорость прямой и обратной реакций уравниваются.

Какую из приведенных характеристик реакции изменит внесение катализатора?

6. Вещество х,не изменяет соотношения между концентрацией исходных и конечных продуктов реакции в состоянии подвижного равновесия, но удлиняет (или сокращает) время наступления равновесия.

В каком случае это вещество можно назвать катализатором?

7. Скорость взаимодействия А+Б увеличилась в 3 раза после добавления вещества К. В качестве конечных продуктов в последнем случае обнаруживаются соединения АК и БК. Является ли вещество К катализатором?