Инструкция к практическому занятию
Работа 1. «Исследование термолабильности ферментов»
Принцип работы:
Каталитическая функция – уникальное свойство белков-ферментов, обусловленная их структурными особенностями. Активный центр фермента формируется на высшем структурном уровне белка, является комбинацией радикалов аминокислот в пространстве. Физические факторы могут изменять пространственную конфигурацию полипептидной цепи, следовательно, влиять на каталитическую функцию белков.
Материальное обеспечение: пробирки, 1% раствор крахмала, реактив Люголя, 10% раствор едкого натра (NaOH), 1% раствор сульфата меди (CuSO4)
Ход работы:
В чистую пробирку отливают небольшое количество неразведенной слюны (2-3 мл) и кипятят ее в течение 5-8 мин, после чего охлаждают. В 3 пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1-ю пробирку добавляют 10 капель некипяченой и разведенной в 10 раз слюны, во 2-ю - 10 капель прокипяченной и разведенной в 10 раз слюны, в 3-ю - 10 капель воды в качестве контроля. Все пробирки помещают в термостат при температуре 38°С на 10 мин. После этого содержимое пробирок делят на две части и проводят качественные реакции на крахмал (субстрат) и глюкозу ( конечный продукт расщепления крахмала).
Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю р-ра Люголя, содержащего йод. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание.
Реакция на глюкозу (реакция Троммера). К 5 каплям иследуемой жидкости приливают 5 капель 10% раствора едкого натра и 3 капли 1% раствора сульфата меди. Осторожно кипятят 1 мин до появления красного окрашивания, которое указывает на наличие глюкозы.
Работа 2. «Исследование влияния рН среды на активность ферментов»
Принцип работы:
Высший структурный уровень белка (чаще третичный, либо четвертичный) формируется за счет водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий радикалов аминокислот. Способность к таким взаимодействиям зависит от степени диссоциации ионогенных групп аминокислот. На последнюю влияет рН среды.
Материальное обеспечение: пробирки, 1% раствор крахмала, реактив Люголя, набор буферных растворов
Ход работы:
Слюну предварительно разводят в 100 раз. Берут 6 пробирок и в каждую наливают по 2 мл буферного раствора с различным значением рН: 6.0, 6,4, 6.8, 7,2, 7,6, 8,0. Затем приливают по 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл разведенной слюны. Перемешивают содержимое пробирок и термостатируют при 38°С в течение 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле р-ва Люголя, перемешивают, наблюдают окраску и отмечают рН, при котором амилаза действует наиболее активно.
Работа 3. «Исследование специфичности ферментов»
Принцип работы:
Способность ферментов избирательно превращать определенные субстраты обусловлена комплементарностью между структурой активного центра и субстрата. Это соответствие друг другу по принципу «ключа и замка» связано с набором радикалов аминокислот в активном центре, несущих определенные функциональные группы (-ОН, -SH, -NH3 + , -COO -), поэтому участвующих в связывании и последующем превращении специфических субстратов. Например, амилаза слюны (фермент 1) способна специфически расщеплять крахмал (субстрат1) до декстринов, которые ращепляются затем до мальтозы и глюкозы (продукт 1). Сахараза (фермент 2) расщепляет дисахарид сахарозу (субстрат 2) на глюкозу и фруктозу (продукт 2).
Материальное обеспечение: пробирки, 1% раствор крахмала, 1% раствора сахарозы (тростниковый сахар), р-в Люголя, 10% раствор едкого натра (NaOH), 1% раствор сульфата меди (CuSO4), амилаза, сахараза
Ход выполнения работы:
Для исследования специфичности амилазы (фермент 1) берут слюну, разведенную в 10 раз. Для изучения действия сахаразы (фермент 2) используют профильтрованную вытяжку из дрожжей.
В четыре пронумерованные пробирки согласно таблице последовательно добавляют:
| № про-бирки | Фермент 1 мл | Субстрат 1 мл | Качественная реакция на крахмал с реактивом Люголя | Качественная реакция на глюкозу - реакция Троммера |
| Амилаза (в разведен- ной слюне) | 1% р-р крахмала | |||
| Амилаза (в разведен- ной слюне) | 1% р-р сахарозы (тростниковый сахар) | |||
| Сахараза (вытяжка из дрожжей) | 1% р-р крахмала | |||
| Сахараза (вытяжка из дрожжей) | 1% р-р сахарозы (тростниковый сахар) |
Пробирки оставляют на 15-20 мин при 38°С. Затем в 1-й и 3-й проводят качественную реакцию на крахмал, а во 2-й и 4-й - качественную реакцию на глюкозу. Описание качественных реакций см. в работе1. Результаты опытов записывают в таблицу.
ВЫВОДЫ:
Подпись преподавателя:
Приложение 1
Граф логической структуры
