Лабораторная работа № 9

ГОРМОНАЛЬНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ КАРПА

Цель работы: освоить технологию гормональной стимуляции производителей карпа.

Задание:

1. Изучить и законспектировать технологию получения зрелых производителей карпа с помощью гормональной стимуляции при различных условиях содержания.

2. В соответствии с полученным вариантом задания выбрать схему гипофизарных инъекций с учетом условий содержания производителей, степени зрелости ооцитов и температуры воды.

3. Рассчитать количество гипофиза, необходимого для инъекции производителям и объем суспензии.

4. Определить примерные сроки созревания производителей.

5. Ответить на вопросы для самопроверки, используя методические указания и рекомендуемую литературу.

Методические указания

Методика получения зрелых половых продуктов от производителей рыб с помощью гормональных инъекций была разработана в СССР Н.Л. Гербильским.

В работах с карпом для инъекций используют водную суспензию ацетонированных гипофизов, полученных от различных видов карповых рыб (карп, лещ, карась и др.) весенней или осенней заготовки.

У производителей карпа гормональная стимуляция проводится при:

- наступлении нерестовых температур;

- раннем получении икры вусловиях регулируемого температурного режима;

- при температуре воды ниже нерестового порога в условиях нерегулируемого темпера­турного режима.

В зависимости от степени зрелости половых продук­тов и температуры воды используются разные схемы гипофизарных инъекций.

Выбор схемы гормональной стимуляции созревания половых продуктов у самок зависит в основном от степени зрелости ооцитов старшей генерации, так как ооциты, находящиеся на разном уровне развития, по-разному реагируют на гипофизарные инъекции.

Степень зрелости половых клеток самок определяют по положению ядра и размеру ооцитов старшей генерации. Если ядро в ооцитах смещено к оболочке, степень зрелости высока, если же ядро размещается почти в центре, то ооциты далеки от зрелости. Миграция ядра к анимальному полюсу свидетель­ствует о переходе ооцитов в период созревания. Икру для определения степени зрелости берут щупом (рис. 52).

г

д

а – вид сбоку; б – вид сверху; в – вид в разрезе по А-А; г – внешний вид;

д – щуп с икринками

Рисунок 52 – Щуп для взятия пробы икры у рыб

В зависимости от степени зрелости половых продуктов самок разделяют на три группы:

1-я группа - особи с хорошо выраженным округлым мягким брюшком, они имеют ооциты высокой степени зрелости (рис. 53);

2-я группа - самки, имеющие довольно твердое брюшко, но в пробе, взятой щупом, ядра в икринках лежат у оболочки; икра таких самок также высокой степени зрелости;

3-я группа - особи с твердым брюшком и ооцитами, далекими от зрелости, ядра в икринках расположены в центре (рис. 54).

Рисунок 53 - Расположение ядра у оболочки икринки

Рисунок 54 – Расположение ядра в центре икринки

После разделения на группы, производителей сортируют по массе, подбирая в один бассейн или лоток особей, близких по размеру, что оказывается удобным при расчете доз гонадотропного материала.

Дозировка гипофизов определяется также их активностью, которая зависит от видовой принадлежности рыбы и ее возраста. Наибольшей активностью обладают гипофизы карпа и сазан; гипофизы леща и карася менее активны. У рыб, достигших половой зрелости, активность гипофизов возрастает в полтора-два раза по сравнению с незрелыми.

Существуют три схемы гипофизарных инъекций.

П о п е р в о й с х е м е при наступлении нерестовой температуры воды получе­ние зрелых производителей обеспечивается однократной инъекцией. Доза гипофиза составляет 2-2,5 мг на 1 кг массы для самки, для самцов - в 2 раза меньше. Время содержания самок при нерестовой температуре до инъекции 4-5 сут.

Сроки созревания самок в зависимости от температуры воды следующие:

- при 17-18 °С - через 20-23 ч;

- при 19-20 °С - через 18-20 ч;

- при 20-22 °С - через 14-18 ч.

П о в т о р о й схеме при раннем получении икры в условиях регулируемого температурного режима во всех случаях необходимо использовать дробную схему гипофизарных инъекций. В зависимости от степени зрелости яичников эта схема применяется в нескольких вариантах:

а) в диапазоне нерестовой температур стабильные результаты созревания самок 1 и 2 групп можно получать при двукратном введе­нии им гонадотропного материала; величина доз гипофизарных инъек­ций в зависимости от температуры воды различна: при температуре 17-18 °С первая доза равна 0,5 мг, вторая - 2,5 мг на 1 кг массы самки; при температуре 19-20 °С первая доза составляет 0,3 мг, вторая – 2,0 мг на 1 кг массы самки; промежуток между первой и второй инъекциями должен быть 12 ч; при этом можно получить одновременное созрева­ние самок.

За более короткий промежуток времени в ооцитах не успевают произойти необходимые морфологические изменения, вызванные введением первой небольшой дозы гонадотропного гормона. В этом случае инъекция второй большей дозы гормона может вызвать нарушения процессов созревания.

б) при работе с самками 3-ей группы хороших результатов созрева­ния (90-100%) можно добиться при постепенном введении увеличива­ющихся доз гонадотропного материала; для стимуляции развития ооцитов, ядра которых находятся еще в центре, наиболее эффективно применять трехкратные гипофизарные инъекции; при отсутствии овуляции икры у большинства самок после третьей инъекции стиму­ляцию можно продолжить, но не более трех раз, при этом доза каждой последующей инъекции должна быть увеличена на 0,25-0,5 мг на 1 кг (табл. 34), промежуток во времени между ними 24 ч.

Продолжительность созревания самок после двукратной инъекции при температуре воды 18-19°С составляет 12-19 ч, после трехкрат­ной - 14-23 ч. При температуре воды 20-21 °С после двукратной инъекции продолжительность созревания самок составляет 12-14 ч.

Таблица 34 - Дозы гипофиза (мг/кг) и интервал (ч) между инъекциями для самок третьей группы

Температура воды, ºС	Первая доза	Интервал	Вторая доза	Интервал	Третья доза	Интервал	Четвертая доза
17-18	0,2		0,4		1,5	-	-
В случае медленного созревания	0,2		0,4		1,5		1,75-2

Стимуляция созревания самцов обеспечивается после однократно­го введения гонадотропного материала. Им вводится половинная доза гипофизов по сравнению с самками, причем инъецирование самцов проводят одновременно с введением самкам последней порции ацетонированных гипофизов (т. е. во время второй или третьей инъекции, в зависимости от избранного варианта).

В условиях регулируемого температурного режима с помощью гипофизарных инъекций от производителей карпа можно получить зрелую икру в любое время года. Однако при прудовом выращивании целесообразно личинок получать при заводском методе не ранее чем за 2-3 недели до сроков естественного нереста, когда уже достаточно прогреваются водоемы и появляется достаточное количество пищи для личинок за счет интенсивного развития кормовых беспозво­ночных.

П о т р е т ь е й с х е м е получение икры при температуре воды ниже нерестового порога в условиях нерегулируемого температурного режима особенно рекомендуется для северо-западных районов. Удов­летворительные результаты можно получить только при проведении дробных инъекций.

Схема инъекции будет зависеть от степени зрелос­ти половых продуктов у самок карпа. Так, от производителей, яичники которых находятся в состоянии, близком к зрелости (четкая поля­ризация ооцитов старшей генерации, ядро смещено к оболочке), можно получить зрелую икру при двукратной схеме введения гонадотропно­го материала.

При температуре воды - 14-15 °С величина первой дозы гипофиза составляет 0,7 мг, второй - 3,5 мг на 1 кг массы самки. При температуре 15-16 °С первая доза равна 0,6 мг, вторая - 3,4 мг на 1 кг. Интервал времени между первой и второй инъекциями должен состав­лять 18 ч.

Если же яичники самок находятся в состоянии, далеком от зрелос­ти (ооциты старшей генерации не обнаруживают признаков поляриза­ции, ядро размещается в центре икринки), созревания самок можно достичь при трехкратном введении гонадотропного материала посте­пенно повышающимися дозами (табл. 35).

Интервал времени между первой и второй инъекциями составляет 6 ч, между второй и третьей - 18 ч.

Таблица 35 - Дозы гипофизарных инъекций при трехкратной схеме гормонального стимулирования в зависимости от температуры воды

Температура воды, ºС	Доза гонадотропного гормона, мг на 1 кг
первая	вторая	третья	всего
14-15	0,3	0,5	2,5	3,3
15-16	0,25	0,5	2,0	2,75

Если самки не созрели, стимуляцию следует продолжить, при этом каждая последующая доза должна быть увеличена на 0,5 мг на 1 кг массы самки и вводиться через 24 ч, но не более трех раз.

Гипофизарные инъекции самцам делают так же, как и в условиях регулируемого температурного режима, т. е. один раз во время введения наи­большей дозы гонадотропного материала самкам (во время второй или третьей инъекции в зависимости от избранной схемы). Доза вводимого гонадотропного материала при инъекции самцов также составляет половину дозы, вводимой самкам.

Созревание самок в условиях низких температур более продолжи­тельное, чем при высоких. При температуре воды 14-15 °С после двух- и трехкратной инъекций самки созревают через 21-22 ч, при темпера­туре воды 16-17 °С длительность созревания самок после двукратной инъекции составляет 12-25 ч, после трехкратной - 18-24 ч. Если самки не созревают через 24-26 ч после последней инъекции при двукратной схеме введения гормона, их высаживают на нагул. При трехкратной схеме инъекций несозревших самок продолжают инъеци­ровать, увеличивая каждую последующую дозу на 0,5 мг на 1 кг. Если после трех дополнительных инъекций самка не созревает, ее высажи­вают на нагул.

Нарушение овуляции может наблюдаться при слишком коротком интервале между инъекциями и при заниженной дозе гипофиза. В то же время завышенная доза гормона при предварительной инъекции может привести к преждевременной или полной овуляции икры. Также при однократной инъекции у плохо подготовленных к нересту самок может овулировать лишь часть ооцитов; остальные, оставаясь в фолликулярных оболочках, при отцеживании икры выпячиваются вместе с тканью ястыка через генитальное отверстие, образуя тромбы.

Появление тромбов у самок может быть обусловлено и перезреванием, а также рядом других причин (травматизацией рыб в преднерестовый период, резкой сменой температуры, неудовлетворительным кислородным режимом и др.).

Основная часть самок с тромбами, как правило, погибает, поэтому таких самок обычно выбраковывают.

Для лучшей сохранности производителей иногда применяют пенициллин, который добавляют к суспензии гипофиза (при каждой инъекции по 50 тыс. МЕ пенициллина независимо от массы рыбы).

Самцы при температуре воды ниже нерестового порога после гипофизарных инъекций созревают хорошо и не требуют проверки на созревание.

Для приготовления водной суспензии отбирают целые, сохранившие свою форму белые или светло-коричневые гипофизы. Водная суспензия приготавливается непосредственно перед работой, т.к. она теряет свои свойства в течение нескольких часов.

Дозу гонадотропного материала, необходимого для инъецирова­ния, рассчитывают следующим образом. Для всей группы самок одного возраста (т. е. близких по массе), отсаженных для получения икры, взвешивают все целые неповрежденные гипофизы на аналитических весах. Если таких весов нет, то всю партию гипофизов взвешивают на аптекарских весах и определяют их среднюю массу. Затем производят расчет количества гипофизов и физиологического раствора для приго­товления суспензии для инъекций. Суспензию готовят на всю группу отсаженных производителей (самок и самцов), с некоторым ее избытком, учитывая возможные потери. Например, если рассчитывают сделать инъекцию 9 самкам, то суспензию готовят на 10.

Отобранные и взвешенные гипофизы сначала помещают в фарфоро­вую ступку и тщательно растирают пестиком до порошкообразного состояния. Затем шприцем добавляют 0,5 мл солевого раствора (6,5 г химически чистого хлористого натрия на 1 л дистиллированной воды) и продолжают растирать гипофизы до получе­ния однородной массы, после чего шприцем добавляют в ступку солевой раствор до расчетного объема.

Количество вводимой рыбе суспензии зависит от дозы ацетонированного гипофиза, поэтому, когда вводят небольшую порцию гонадотропного материала, суспензию разбавляют из расчета 0,5 мл на одну самку. При второй инъекции, когда вводится большая доза гипофизов, суспензию готовят из расчета 1 мл на самку. Однако, количество суспензии, вводимой одной самке не должно превышать 1 мл.

Например, для инъекции отобрано 10 самок средней массой 3 кг. Величина первой дозы гипофи­за - 0,5 мг на 1 кг. Следовательно, для инъекции 10 самок необходимо 3 х 10 х 0,5 = 15 мг гипофизов. При средней массе 1 гипофиза 2,5 мг потребуется 15 : 2,5 = 6 гипофизов. Объем суспензии для 10 самок при введении первой дозы составит 0,5 х 10 = 5 мл, второй дозы - 1 х 10 = 10 мл.

Для выполнения задания необходимо выбрать схему инъекций, рассчитать количество гипофиза и объем суспензии и установить сроки созревания производителей карпа при следующих условиях:

№ п/п	Количество производителей в стаде, шт.	Средняя масса, кг
	Самки – 20	8,0
Самцы – 12	6,0
	Самки – 50	5,0
Самцы – 30	4,0
	Самки – 60	7,0
Самцы – 56	6,0
	Самки – 90	4,5
Самцы – 54	3,5

а) при нерестовых температурах воды;

б) при регулируемом температурном режиме и раннем получении икры; яичники самок близки к зрелости, температура воды 17-18 ºС;

в) то же, температура воды 19-20 ºС;

г) то же, яичники самок далеки от зрелости, температура воды 17-18 ºС;

д) то же в случае медленного созревания самок;

е) в условиях нерегулируемого температурного режима и температуре воды ниже нерестового порога; яичники самок в состоянии, близком к зрелости, температура воды 14-15 ºС;

ж) то же при температуре воды 15-16 ºС;

з) то же, яичники самок далеки от зрелости, температура воды 14-15 ºС;

и) то же, температура воды 15-16 ºС.

Результаты выполненной работы представить в виде краткого пояснения и таблицы, пример которой приведен ниже (табл. 36).

Таблица 36 – Количество гипофиза (шт.) и величина суспензии (мл), необходимая для инъекции производителей

Количество производителей, шт.	Средняя масса, кг	Кратность инъекции
первая	вторая	третья	всего
шт.	мл	шт.	мл	шт.	мл	шт.	мл
Самки
Самцы
Итого

Вопросы для самопроверки

1. При каких условиях проводят гормональную стимуляцию созревания производителей карпа?

2. По каким признакам судят о степени готовности самок карпа к нересту?

3. Перечислите возможные схемы гормональной стимуляции производителей карпа.

4. От чего зависит выбор нужной схемы гормональной стимуляции?

5. Как рассчитать количество гипофиза и объем суспензии гормонального препарата?