И пероксидазы по Михлину и Броневицкой
Принцип метода определения активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом:
| Н ½ | Н ½ | |||||||||||||
| С // \ | С // \ | |||||||||||||
| Н¾ С С ¾ ОН ½ || + 1/2 О 2 | полифенолоксидаза ¾¾¾¾¾¾¾¾> | Н¾ С С = О ½ | + Н2О | ||||||||||||
| Н¾ С С ¾ ОН \\/ С | Н¾ С С = О \\/ С | |||||||||||||
| ½ Н | ½ Н | |||||||||||||
| пирокатехин | о-хинон | |||||||||||||
  О= С ¾¾ | Н | Н | О= С ¾¾ | |||||||||||
| ½ | ½ | ½ | ½ | |||||||||||
| НО¾С | С | С | О = С | |||||||||||
 || О | //\ | //\ | ½ О | |||||||||||
 НО¾С + | Н¾ С С = О | Н¾ С С¾ ОН | О = С | |||||||||||
| ½ | ½ ½ | ¾¾> | ½ || | + | ½ | |||||||||
| Н¾С¾¾ | Н¾ С С = О | Н¾ С С ¾ ОН | Н ¾ С ¾¾ | |||||||||||
| ½ | \\ / | \\ / | ½ | |||||||||||
| НО¾С¾Н | С | С | НО¾С¾Н | |||||||||||
| ½ | ½ | ½ | ½ | |||||||||||
| СН2ОН | Н | Н | СН2ОН | |||||||||||
| аскорбиновая о - хинон пирокатехин дегидроаскорбиновая кислота кислота | ||||||||||||||
  О=С ¾¾ | О= С ¾¾ | |||||||||||||
| ½ | ½ | |||||||||||||
| НО¾С | НО¾С¾ J | |||||||||||||
 || О | ½ О | |||||||||||||
 НО¾С + | J2 | ¾¾> | НО¾С¾ J | |||||||||||
| ½ | ½ | |||||||||||||
| Н¾С¾¾ | Н¾С¾¾ | |||||||||||||
| ½ | ½ | |||||||||||||
| НО¾С¾Н | НО¾С¾Н | |||||||||||||
| ½ | ½ | |||||||||||||
| СН2ОН | СН2ОН | |||||||||||||
| неокисленная a,b дииод- аскорбиновая кислота аскорбиновая кислота | ||||||||||||||
Ход работы. Получение ферментной вытяжки.
3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.
Определение активности о–дифенолоксидазы (Е0). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).
Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.
Определение суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Ео+n).
К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 °С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.
Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:
Еn = Еo+n – Еo
Результаты записывают в таблицу 6.
Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты
| Материал | Ферменты | ||||||||
| о-дифенолоксидаза и пероксидаза | о-дифенолоксидаза | пероксидаза | |||||||
| Vo | Vk | Vk-Vo | Ео+п (Vk-Vo)20 ¾¾¾ n | Vo | Vk | Vk-Vo | Ео (Vk-Vo)20 ¾¾¾ n | Еn = Еo+n – Еo | |
Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I2;
Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I2;
Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I2/г;
Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I2/г;
Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I2 / г;
n– навеска, г.
Материалы и реактивы: картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).
Оборудование: ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.