Реакция на тирозин (Миллона)
Принцип метода.При добавлении к раствору белка реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте с небольшим количеством NaNO2) при кипячении образуется кроваво-красный осадок ртутной соли динитротирозина, благодаря наличию в тирозине фенольного кольца. Химизм реакции можно предоставить следующим образом:
 |
Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая, при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание, маскирующее реакцию Миллона.
Реактивы: раствор яичного белка; раствор фенола 0,1%; раствор желатина 1%; реактив Миллона (в 57 мл конц. азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоде, а затем, нагревая на водяной бане; полученный раствор разбавляют 2 объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка).
Ход работы: Берут три пробирки, в первую пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую — 5 капель раствора фенола, а в третью — 5 капель раствора желатина. В каждую пробирку приливают по 3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. В пробирке с яичным белком появляется кроваво-красное окрашивание, в пробирке с фенолом — розовато-красное, а в пробирке с желатином жидкость бесцветна, т.к. белки, не содержащие тирозина, этой реакции не дают.
Вопросы для самоконтроля.
1. Объясните принципы цветных реакций на белки и аминокислоты.
2. Как каждое из приведенных ниже полипептидов ведет себя при различных цветных реакциях на белок: треонил-аспарагил-лизил-тирозил-глутаминовая кислота и серил-цистеил-аланин?
3. Все ли пептиды дают положительную биуретовую реакцию?
4. Почему пролин дает с нингидрином желтую окраску?
5. Наблюдается ли положительная реакция Фоля в присутствии метионина? Почему?
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ
Теоретическая часть.
Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, липидов и их метаболитов. В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографию подразделяют на несколько видов:
адсорбционная — основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента;
распределительная — основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях:
ионообменная — основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы сорбента;
осадочная — основана на образовании труднорастворимых осадков в определенной последовательности;
диффузионная — основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул (гель-фильтрация).
Различают хроматографические методы анализа и по технике выполнения их: колоночная и плоскостная (на бумаге или в тонком слое). В зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию подразделяют на газовую, жидкостную и газожидкостную. Различаются виды хроматографии и по направлению движения растворителя (подвижной фазы): восходящая, нисходящая, одномерная, двухмерная и радиальная.
Практическая часть.