Электрические свойства белков

Белки являются амфотерными полиэлектролитами (полиамфолитами), при этом группами, способными к ионизации в растворе, являются карбоксильные остатки боковых цепей кислых аминокислот (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) и азотсодержащие группы боковых цепей основных аминокислот (в первую очередь ε-аминогруппа лизина и амидиновый остаток CNH(NH2) аргинина, в несколько меньшей степени — имидазольный остаток гистидина). Белки как полиамфолиты характеризуются изоэлектрической точкой (pI) — кислотностью среды pH, при которой молекулы данного белка не несут электрического заряда и, соответственно, не перемещаются в электрическом поле (например, при электрофорезе). Величина pI определяется отношением кислотных и основных аминокислотных остатков в белке: увеличение количества остатков основных аминокислот в данном белке ведёт к увеличению pI; увеличение количества остатков кислых аминокислот приводит к снижению значения pI.

Значение изоэлектрической точки является характерной константой белков. Белки с pI меньше 7 называются кислотными, а белки с pI больше 7 — основными. В целом, pI белка зависит от выполняемой им функции: изоэлектрическая точка большинства белков тканей позвоночных лежит в пределах от 5,5 до 7,0, однако в некоторых случаях значения лежат в экстремальных областях: так, например, для пепсина — протеолитического фермента сильнокислого желудочного сока pI ~ 1[9], а для сальмина — белка-протамина молок лосося, особенностью которого является чрезвычайно высокое содержание аргинина, pI ~ 12. Белки, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами за счёт электростатического взаимодействия с фосфатными остатками нуклеиновых кислот, часто являются основными белками. Примером таких белков служат гистоны и протамины.

Количественные методы определения белка.

Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.

Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.

БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД

Принцип метода. Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

Фотоэлектроколориметр.

Фотоэлектроколориметр (ФЭК) вошел в лабораторную практику настолько широко, что большая часть анализов заканчивается при помощи этого прибора. Принцип действия прибора базируется на основном законе колориметрии, который характеризуется прямолинейной зависимостью между концентрацией окрашенного раствора и его оптической плотностью. Метод измерения относится к объективным, независимым от глаза человека. Индивидуальные ошибки сведены к минимуму. Наиболее распространенными фотоколориметрами в нашей стране являются ФЭК-56 (ФЭК-56М). В них имеются два вакуумных фотоэлемента, токи которых направлены навстречу друг другу по дифференциальной схеме. При равенстве интенсивности левого и правого световых потоков стрелка микроамперметра устанавливается на нуле.

Ранее применявшийся нулевой прибор (индикаторная лампа) себя не оправдал и был заменен стрелочными микроамперметрами. Левый и правый барабан ФЭКа независимы, и каждый из них управляет своей диафрагмой. Порядок работы на ФЭК-56. При первом способе устанавливают электрический нуль при закрытой шторке (световые потоки перекрыты), при этом стрелку микроамперметра устанавливают на нуле. В левый кюветодержатель помещают кювету с нулевым раствором (или контрольным раствором), в правый — кювету с опытным (анализируемым) раствором. Правый барабан устанавливают на нуль оптической шкалы (100 по пропусканию). Вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на нуль. Затем в правый кюветодержатель вводят кювету с нулевым раствором. Интенсивность правого светового потока возрастает и стрелка микроамперметра отклоняется. Вращением правого барабана уменьшают интенсивность светового потока, пока оба потока не сравняются (стрелка на нуле). Отсчет производят по правому барабану. Как можно заметить, при описанном способе измерения для каждого замера опытной пробы необходимо заново уравнивать световые потоки по нулевому раствору. При большом числе однотипных анализов это замедляет работу. На практике оправдал себя другой порядок измерения, ускоряющий работу примерно в 2 раза. При этом способе уравнивание светового потока с контролем производится один раз на серию из 10—15 определений, после чего снова проверяют контроль и продолжают измерения. Второй способ измерения состоит в следующем. После прогрева ФЭКа в правый и левый пучок света помещают кюветы с контрольным раствором. Индекс правого барабана ставят на нуль экстинкции (100% по пропусканию). Вращением левого барабана стрелка прибора устанавливается на нулевое деление. Затем в левый пучок света вместо кюветы с контролем вводят такую же кювету с опытной пробой. Стрелка прибора отклоняется от нуля. Вращением правого барабана (от себя) стрелку микроамперметра устанавливают на нуль (при неизменном положении левого барабана). Отсчет ведут по правому барабану. В дальнейшем опытную пробу в левом кюветодержателе меняют на следующую и снова уравнивают фототок вращением правого барабана. Снимают отсчет и т. д. (левый барабан остается неподвижным). Для получения правильных результатов при фотоколориметрии большое значение имеет чистота кювет. Переставляя кюветы, их следует брать пальцами только за боковые грани, через которые не проходит световой поток. Для исследования биологических веществ применяются специально очищенные реактивы и вода. Между тем при проведении контрольного опыта, когда проделываются все операции с реактивами (только без биологического материала), обычно обнаруживается окраска, определяемая как искомое вещество (но в меньшем количестве). Эту поправку на контрольную пробу нужно вычесть из результата анализа. В этом

и заключается смысл понятия «против контроля». Вычитание контроля может быть выполнено двумя способами: а) арифметическим вычитанием экстинкции контроля (или его вычисленного значения). В ФЭКе в оба кюветодержателя ставят кюветы с чистой водой и уравнивают фототоки. Затем заменяют воду контрольной пробой. Измеряют экстинкцию контроля. Так же измеряется опытная проба. Полученная экстинкция контроля вычитается из экстинкции опыта (измерения проводятся на фоне воды); б) автоматическим вычитанием. В оба световых потока ставят кюветы с контрольной пробой, и после уравнивания фототоков в измерительной стороне заменяют контрольную пробу на опытную. В этом случае измерение опытной пробы происходит на фоне контроля, который автоматически вычитается в процессе измерения. Величина контроля остается неизвестной. Основной закон фотометрии предполагает, что в определенных условиях график зависимости между концентрацией окрашенного раствора и его экстинкцией (оптической плотностью) выражается прямой линией. На практике, однако, наблюдаются отклонения, вызванные деформацией молекул, недостаточной монохроматичностью света, изменением степени диссоциации ионов и другими причинами. Чаще отклонения бывают с уменьшением пропорциональности, когда равномерное увеличение концентрации вещества сопровождается все меньшим приростом экстинкции, отсюда и название «калибровочная кривая». В зависимости от свойств конкретного вещества, стабильности его окрашенного раствора, воспроизводимости данных применяют тот или иной способ калибровки и дальнейшего его определения. Обычно это указывается в описании метода. Если в выбранном диапазоне концентраций сохраняется прямая пропорциональность с экстинкцией при хорошей воспроизводимости, то в этом случае можно вести расчет результатов анализа как по калибровочному графику, так и с помощью вычисленного коэффициента. Если график аналогичен линии 2, то расчет можно вести только по калибровочному графику, поскольку нет постоянного коэффициента на всем протяжении графика. Основным требованием к такому графику является хорошая воспроизводимость и стабильность при его повторном построении. Во всех случаях работы с калибровочным графиком его надо периодически проверять. Периодичность проверки устанавливается опытным путем. В среднем это можно делать раз в 3 мес. или реже. Нередко на интенсивность окраски исследуемого вещества влияет качество одного из применяемых реактивов. Следовательно, при замене этого реактива следует проверить калибровочный график. То же нужно делать при замене осветительной лампы фотоколориметра или после его ремонта. Проверку не обязательно проводить в полном объеме. Достаточно бывает проверить 2 — 3 точки. При совпадении найденных результатов с прежними, график остается в силе. Так же поступают при работе с коэффициентом. Существуют вещества, чрезвычайно чувствительные к малейшим отклонениям в процессе проведения анализа (например, к условиям кипячения и др.). Если взять две одинаковые пробы и обработать их отдельно, то можно получить неодинаковую окраску (экстинкцию). В таких случаях опытная и стандартная

пробы должны обрабатываться вместе (одновременно), чтобы условия проведения реакции были одинаковыми. Расчет ведут по отношению к стандарту. При этом результат тем точнее, чем ближе концентрации опытных и стандартных проб.

Прицип метода диализа.

Диализ - искусственное очищение крови и других жидкостей человеческого тела от скопившихся шлаков, когда органы самого человека неспособны нормально выполнять эти функции. Обычно кровь фильтруется в почках, которые задерживают полезные вещества, а вредные выделяют с мочой. При заболеваниях почек, когда одна или обе почки не функционируют, больному необходим диализ. Существуют два метода диализа. Первый - очищение крови через брюшину (перитониальный) в самом теле, второй - подключение к искусственной почке.

Принцип действия диализа

Принцип действия диализа основан на законах осмоса. Для того, чтобы эти законы действовали, необходимы очень тоненькие мембраны, проницаемые только для воды и определенных веществ, растворенных в ней. Когда с обеих сторон этих мембран образуется различная концентрация жидкости, тогда эти жидкости пытаются проникнуть сквозь мембрану, чтобы выровнять уровень концентрации и установить равновесие: если с одной стороны мембраны каких-либо веществ больше, чем с другой, часть их попадает на другую сторону. Естественные мембраны человеческого тела - это легкие, брюшина и капилляры почек; эти мембраны пропускают определенные вещества, а другие составные части крови в ней и остаются. Точно таков механизм действия диализа, который назначается при нарушении функции почек или отравлениях (грибами, лекарствами). Существует много людей, которым диализ повторяют несколько раз в неделю. При тяжелых заболеваниях почек гемодиализ (искусственная почка) еще может обеспечить почти нормальную жизнь, однако известно, что лучшее решение - это пересадка почки (трансплантация).

Классификация белков.

В настоящее время еще не разработана стройная система номенклатуры и классификации белков. Традиционная классификация белков по группам, основанная, скорее, на случайных показателях (физико-химические свойства, форма молекул, локализация и происхождение, аминокислотный состав), уже не отвечает полностью возросшему уровню знаний о их структуре и функциях. Из огромного количества природных белков структура и функции расшифрованы для относительно небольшого числа (не более нескольких сотен), и поэтому структура и функции белков пока не могут служить основой для их рациональной классификации. Пожалуй, только для одной группы белков, обладающих способностью катализировать химические реакции, т.е. ферментов, разработана стройная система номенклатуры и классификации, в основу которой положены типы катализируемых химических реакций и химическая природа реагирующих веществ. Однако полностью идентифицированные до сих пор ферменты также составляют незначительную долю белков (ферментов описано более 3000). Тем не менее функциональный принцип, рекомендуемый некоторыми авторами, хотя и не может служить универсальной основой для классификации всех белков, представляет определенный интерес. В соответствии с функциональным принципом различают 12 главных классов белков: 1) каталитически активные белки (ферменты); 2) белки-гормоны (хотя есть и стероидные гормоны); 3) белки-регуляторы активности генома; 4) защитные белки (антитела, белки свертывающей и антисвертывающей систем крови); 5) токсические белки; 6) транспортные белки; 7) мембранные белки; 8) сократительные белки; 9) рецепторные белки; 10) белки-ингибиторы ферментов; 11) белки вирусной оболочки; 12) белки с иными функциями.

Были предприняты также попытки классифицировать белки, исходя из особенностей вторичной и третичной структуры. В соответствии с этим различают α-, β-, α+β- и α/β-белки. α-Белки содержат только α-спирали (не менее 60%), β-белки – только β-структуры (не менее двух антипараллельных цепей), α+β-белки – те и другие структуры в пределах одной полипептидной цепи (пример – молекулы лизоцима), а класс α/β-белков содержит множество α- и β-структур, чередующихся вдоль полипептидной цепи или домена (см. рис. 1.19). Домены создаются объединением и чередованием α-спиралей и β-слоев, между которыми открываются более рыхлые структуры.

Учитывая необходимость для студента-медика основательного знакомства с отдельными группами белков, которые могут служить предметом изучения в его будущей профессиональной деятельности (например, белки крови), приводим старую классификацию белков с краткой характеристикой новых данных о структуре, составе и свойствах отдельных представителей. Согласно этой классификации, обширный класс белковых веществ в зависимости от химического состава делят на простые и сложные белки.

Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.

Сложные белки – это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого про-стетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.

Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др. Классификация сложных белков (см. главу 2) основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента. В соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их входят пигменты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), гликопротеины (содержат углеводы), липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).