Коэффициент пересчета азота на белок в биологическом материале

Методы определения белка в биологическом материале осно­ваны на определении содержания общего азота:

ОА = БА + НБА,

где ОА - общий азот; БА - белковый азот; НБА - небелковый азот.

Массовая доля азота to (N) = 16 %, т. е. в 100 г белка содер­жится 16 г азота. Составляем пропорцию:

100 г Б - 16 г N

хгБ-lrN

х = 6,25,

т. е. в 6,25 г белка содержится 1 г азота.

Коэффициент пересчета азота на белок в биологическом ма­териале К = 6,25.

Физико-химические свойства белков

1. Для белков характерна большая молекулярная масса (М = 6 • 10³—6 • 10⁷). Для определения молекулярной массы исполь­зуются различные физические методы: гравитационный, гельфильт-рационный, электрофоретический и др.

2. Белки — гидрофильные, т. е. имеющие сродство к воде, соеди­нения. Молекулы воды образуют гидратные оболочки белков.

3. Белки — амфотерные полиэлектролиты, так как содержат -СООН- и -NH₂-rpynnbi.

При изменении рН среды происходит подавление диссоциа­ции карбоксильных или аминогрупп, изменяется общий заряд бел­ковой молекулы.

4. Изоэлектрическое состояние белков — электронейтральное состояние, когда суммарный заряд белка равен нулю для конкрет­ного значения реакции среды.

В изоэлектрической точке (ИЭТ) белок является наименее устой­чивым. Электронейтральные молекулы легко сближаются, склеива­ются, коагулируют, выпадают в осадок.

Значение рН, отвечающее ИЭТ белка, определяется числом ионогенных групп. Если белок содержит больше основных амино­кислот, ИЭТ выше 7, при преимущественном содержании кислых аминокислот (моноаминодикарбоновых) — ниже 7. Для большин­ства глобулярных белков рН 4,5—6,5. *

Для белков со щелочными свойствами ИЭТ наступает при рН 10—12 (рН > 7), для белков с кислотными свойствами — при рН < 7.

Изоэлектрическую точку следует отличать от изоионной точки. Изоионной точкой называется такое значение рН, при котором число протонов, связанных с основными группами, равно числу протонов, отданных диссоциированными кислотными группами в белкой молекуле. Изоионной точке соответствует такое значение рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю в уао-виях полного отсутствия электролитов в растворе.

Изоэлектрическая и изоионная точки совпадают, когда растер белка не содержит никаких других ионов, кроме ионизированях остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующий при диссоциации воды.

5. Денатурация белка — нарушение нативной (природной) про­странственной структуры белковой молекулы, приводящее к умеь-шению или полной потере ее растворимости, изменению физко-химических свойств белка, утрате биологической активности. Денау-рация — это необратимое осаждение белков, при котором проиео-дит разрушение четвертичной, третичной и вторичной структур (jhc-щепление дисульфидных, гидрофобных, ионных, водородных связи). Первичная структура не разрушается, денатурация не сопровояда-ется разрывом ковалентных связей в составе полипептидной ции.

Денатурирующие факторы подразделяются на физичесие и химические.

К химическим факторам относятся:

— концентрированные минеральные кислоты (H₂SO₄, HC1, HN0₃);

— катионы тяжелых металлов, анионы иода и тиоцианата;

— органические растворители (низшие спирты, этиленгликиь, диоксан, диметилсульфоксид);

— трихлоруксусная кислота;

— сульфосалициловая кислота;

— таннин;

— мочевина, формамид, гуанидинхлорид и другие амиды. Максимальное денатурирующее действие мочевина и др]тие

амиды оказывают при высоких концентрациях (6 М — 10 М). Физическими факторами являются:

~ высокая температура;

— высокое давление (5 000-10 000 атм.); ~ энергичное встряхивание;

— облучение звуковыми волнами высокой частоты; ~ ультрафиолетовое излучение;

~ ионизирующее излучение.

При денатурации белков пептидные связи становятся более Доступными для действия протеолитических ферментов, протеолиз денатурированных белков протекает с большей скоростью, чемнативных. Полная денатурация белков (ферментов) в большинстве случаев необратима, однако иногда их удается ренатурировать.

Способность к ренатурации после нагревания характерна для фермента трипсина. Необходимым условием его ренатурации являет­ся медленное охлаждение белка до комнатной температуры ("отжиг"), при этом восстанавливается нативная конформация и биологическая функция трипсина.

6. Гидролиз белков — характерное свойство белковых молекул. Конечными продуктами гидролиза являются аминокислоты.

Гидролиз подразделяется:,

— на кислотный;

— щелочной;

— ферментативный.

Ферментативный гидролиз белков протекает с участием протео-литических ферментов.

7. Высаливанием называется осаждение белков из водных ра­створов под действием высококонцентрированных нейтральных со­лей (солей щелочных и щелочноземельных металлов). Высаливание — обратимое осаждение при определенных условиях.

Высаливание — это процесс, обратный солевому растворению, т. е. возрастанию растворимости белков в воде при добавлении небольших концентраций нейтральных солей ((NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, MgSO₄ и др.). В результате увеличивается степень диссоциации ионизированных групп белка, происходит экранирование заряжен­ных групп белковых молекул, увеличение диэлектрической посто­янной воды.

При высаливании происходит разрушение гидратных оболочек. Относительная эффективность высаливающего действия различных ионов зависит от их размера, величины заряда, способности к гидра­тации. При больших концентрациях ионов в растворе они притяги­вают к себе от заряженных групп белка поляризованные молекулы воды и нарушают гидратную оболочку белка, которая предотвра­щает его осаждение.

По способности к высаливанию белков из водного раствора анионы и катионы образуют лиотропные ряды — ряды Гофмейстера:

— для анионов

SO/" > F- > [Цитрат?- > [Тартрат]²- > СН₃СОО" > С1" > Вг > > \~ > CNS" (роданид);

— для катионов

Ва²⁺> Sr²⁺ > Са²⁺ > Mg²⁺ > Cs⁺ > Pb⁺ > К⁺ > Na⁺ > Li⁺.

На практике для высаливания часто используют NaCl, (NH₄)₂SO₄ и MgSO₄. Хлорид натрия осаждает белки слабее, чем сульфат аммо­ния, так как обладает меньшей дегидратирующей способностью (в соответствии с положением ионов в ряду Гофмейстера).

8. Водоудерживающая способность белков мышечной ткани. Белково-водный коэффициент.

Белки мышечной ткани обладают высокой влагоудерживающей способностью (БУС), которую определяют как количество клеточного сока, выделенного тканью при механическом воздействии на нее, и выражают в процентах. Например, величина ВУС мяса рыбы колеб­лется от 10 до 25 %, зависит от вида рыбы, степени свежести и т. д.

Белково-водный коэффициент (БВК) — это отношение содер­жания белка к содержанию воды.

ВУС и БВК играют важную роль в технологических процессах.

9. Оптические свойства. Белки поглощают ультрафиолетовый свет в трех областях:

— поглощение при длинах волн более 250 нм с максимумом около 280 нм обусловлено присутствием трех циклических амино­кислот (триптофана, тирозина, фенилаланина). Основной вклад дают триптофан (Я_тах= 278 нм) и тирозин (А,_тах= 275 нм);

— поглощение при 210—250 нм имеет сложную природу и опре­деляется присутствием водородных связей, а-спиральных участков, наличием ароматических и других аминокислот;

— поглощение при 190нм обусловлено наличием в белке пептид­ных связей.

На этом свойстве основан спектрофотометрический метод ко­личественного определения белка (в основном по интенсивности поглощения при 280 нм). При работе с белками условно принима­ют, что одна единица оптической плотности раствора при 280 нм соответствует концентрации белка 1 мг/см³ при рабочей длине кюветы 1 см. s

Для видимого диапазона спектра 380—760 нм способностью поглощать свет обладают только окрашенные белки — хромопроте-^ины (гемоглобины, цитохромы, флавопротеины, "голубой" белок).

В инфракрасной области спектра (760—10 000 нм) свет погло­щают все белки. ИК-спектроскопию используют для анализа струк­туры белка.