Химические реакции и хроматография

Для получения предварительной информации о структурных особенностях выделенных флавоноидных соединениях используют химические методы анализа. Флавоноиды обнаруживают по качествен­ным реакциям.

1. Цианидиновая проба или проба Шинода (Chinoda). Флавонолы, флаваноны и флавоны при восстановлении магнием в присутствии соляной кислоты (конц.) дают красное или оранжевое окрашивание, обусловленное образованием антоцианидинов:

Кверцетин

Цианидин хлорид

2. Цианидиновая проба по Брианту (продолжение первой реакции). При последующем разбавлении содержимого пробирки водой и добавлении октилового или бутилового спиртов малиновая окраска в случае агликоновой природы флавоноидов переходит в органическую (верхняя фаза), а при исследовании гликозидов флавоноидов остается в водной фазе (флавилевые пигменты гликозидов растворяются в воде).

3. Реакция с алюминием хлоридом. Флавоноиды с 1 - 2% спиртовым раствором алюминия хлорида образуют окрашенные соединения (желтая, зеленая окраска), имеющие желто-зеленую флуоресценцию при длине волны 366 нм (батохромный сдвиг). Следует отметить, что в образовании батохромного комплекса прежде всего принимают участие свободные 3- и 5- ОН -группы флавоноидов. Данная реакция довольно специфична и часто используется в методиках количественного определения.

Гиперозид

Батохромный комплекс гиперозида

Кверцетин Батохромный комплекс кверцетина

Подобные комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет, флавоноиды дают и с солями других тяжелых металлов (свинец, сурьма, бериллий и др.), но данные реакции большого практического значения с точки зрения фитохимического анализа не имеют (за исключением хлорокись циркония).

4.Реакция с хлористым цирконилом(ZnOCl₂) (Реакция Хензеля-Хьерхаммера). В результате этой реакции появляется ярко-желтая окраска и желто-зеленая флуоресценция. По аналогии с реакцией Вильсона, при добавлении к содержимому пробирки нескольких кристаллов лимонной кислоты желтая окраска исчезает, если в качестве продукта реакции выступал неустойчивый шестичленный комплекс.

5. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона). 3- и 5-гидрокси флавоны и 3- и 5-гидрокси флавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой) кислоты, образуя ярко-желтое окрашивание с желтовато-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса), в случае участия в реакции 3-ОН-группы образуется устойчивый пятичленный комплекс, который не разрушается при добавлении лимонной или щавелевой кислот. Флавоноиды, имеющие свободную 5-ОН-группу также дают положительную реакцию, но образуемый при этом шестичленный комплекс после добавления соответствующих органических кислот разрушается (окраска и флуоресценция исчезают).

Гиперозид Батохромный комплекс гиперозида

Кверцетин

Батохромный комплекс кверцетина

6. С раствором аммиака флавоны, флаваноны, флавонолы и флаванонолы дают желтое окрашивание, переходящее при нагревании в оранжевое или красное. В случае халконов и ауронов тотчас же образуется красное или пурпурное окрашивание. Чистые катехины окраски не дают, однако присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления) вызывает появление желтой окраски. Антоцианы при наличии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание.

Эту реакцию можно проводить с парами аммиака при использовании хроматографии на бумаге. Темно-коричневые пятна гликозидов флавонов и флаванолов (при осмотре в УФ свете) при обработке парами аммиака приобретают желто-зеленую флуоресценцию.

7. Реакция с едкими щелочами (NaOH, KOH). При использовании слабых растворов щелочей(1-2%) реакция идет с образованием халконов (разрывается 1-2 связь производных флаванона и флавона). В случае обработки флавоноидов 30% раствором щелочи наблюдается глубокая деструкция молекулы с образованием соответствующих артефактов (из кверцетина, например, образуется протокатеховая кислота и флороглюцин).

8. Флавоноиды, содержащие свободные ароматические ОН-группы реагируют с диазореактивом (диазотированная сульфаниловая кислота, диазобензосульфокислота в щелочной среде) с образованием окраски различных оттенков (лимонно- желтой, оранжевой и др.) Данная реакция иногда используется в методиках количественного определения флавоноидов.

9. Реакция с треххлорным железом. Флавоноиды с 1% спиртовым раствором FeCl₃ дают коричневую (3-ОН-группа) или зеленую (5-ОН-группа) или синюю (3 4 5 OH-группы) окраски.

10. Флавоноиды с минеральными кислотами концентрированными образуют оксониевые соли (ярко-желтое или ярко-оранжевое окрашивание).

11. Катехины с 1% раствором ванилина в концентрированной HCl образуют красно-малиновое окрашивание (производные флороглюцина и резорцина).

12. Флавоноиды в зависимости от строения имеют различную флуоресценцию, чаще всего желто-зеленую (агликоны) или темно-коричневую (гликозиды). Аномально ведут себя 5-О-гликозиды флавоноидов, для которых характерна ярко-голубая флуоресценция (флавоноиды хвоща полевого).

Качественные реакции в настоящее время применяют в сочетании с хроматографическими методами.

Рядом исследователей показано, что существует определенная зависимость между химическим строением флавоноидов и хроматографическим поведением, Основные закономерности сводятся к сле­дующему :

1.Величина Rf снижается с увеличением гидроксильных групп в молекуле.

2.Метилирование гидроксильных групп вызывает повышение величины Rf агликонов.

3.Гликозидирование обусловливает понижение величины Rf. Образование биозида приводит к меньшему снижению величины Rf, чем образование дигликозида.

4.Ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению Rf.

5.Орто- и вициальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения Rf.

Чаще всего при анализе флавоноидных соединений используют бумажную или тонкослойную хроматографию.

Пятна флавоноидов на хроматограммах, как правило, не окрашены или имеют очень слабую окраску и поэтому недостаточно хо­рошо просматриваются в видимой области спектра. Для повышения чувствительности и избирательности методик хроматографического анализа применяют реактивы, способные образовывать окрашенные соединения и флуоресцировать при просматривании в УФ-свете.

Тонкослойная и бумажная хроматография с использованием проявляющих реактивов позволяет ориентировочно установить структуру агликонов флавоноидов и определить расположение гидроксильных групп у С-3, С-5, С-7, С-8, а также наличие диоксигруппировки в боковом фенильном радикале. При хроматографировании в тонких слоях 3-монозиды флавоноидов могут быть отделены от 3-биозидов, а последние - от 3,7-дигликозидов.

Для обнаружения гликозидов и агликонов используют спиртовый раствор алюминия хлорида, хлористый цирконил с лимонной кислотой, раствор едкого калия, раствор треххлористой сурьмы в четыреххлористом углероде, 1% ванилин в конц. соляной кисло­те, раствор железоаммонийных квасцов, пары аммиака и другие.

Для обнаружения сахаров применяют анилин-фталатный реактив.

Хроматографирование проводят в следующих системах раство­рителей: бутанол-уксусная кислота-вода, 15% уксусная кислота, бензол-уксусная кислота-вода, уксусная кислота-соляная кислота-вода, этилацетат-муравьиная кислота-вода и другие.

Как уже отмечалось, наряду с бумажной широко применяется и тонкослойная хроматография. В качестве сорбентов используют порошок целлюлозы в смеси с гипсом, силикагель, капрон и ацетилированный полиамид, магнезол. кремневую кислоту, поливинилпирролидон, полиакрилнитрил.

Для получения хроматограмм применяют следующие системы растворителей: уксусная кислота-муравьиная кислота-вода(10:2:3), бутанол-уксусная кислота-вода(4:1:5), хлороформ-ацетон-метанол(36:1:1), хлороформ-ацетон-метанол-гептан(36:1:1:1), 15% уксусная кислота, м-крезол-уксусная кислота-вода(50:2:48) и другие. Для хроматографии более гидрофобных соединений (флавонов, изофлавонов) основными компонентами смеси являются липофильные растворители: бензол, толуол, хлороформ в смеси с ацетоном, спиртами (этанол, метанол), с простыми и сложными эфирами, для гликозидов и флавонолов - этилацетат, насыщенный водой в комбинации с кислотой или спиртом.

Идентификацию флавоноидов проводят по значению Rf с помощью "свидетелей". Следует обратить внимание на то, что из-за различий в бумаге, растворителях и в других условиях идентификация методами бумажной и тонкослойной хроматографии требует непосредственного сравнения с достоверными образцами на том не листе бумаги или пластины и использавания нескольких систем растворителей и реагентов для опрыскивания.

Флавонолы и 7-гликозиды флавоноидов, как правило, имеют желтую окраску пятен на хроматограммах при просматривании в УФ-свете, а флавоны, флаваноны и гликозиды - бурую или коричневую окраску, ксантоны - оранжевую, изофлавоноиды в данных условиях не проявляются.

Для отличия агликонов и гликозидов необходимо проводить параллельное хроматографирование в системе хлороформ-уксусная кислота-вода (13:6:1) и в системе 15% уксусной кислоты.

УФ-спектроскопия

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой или дифференциальной спектрофотометрии является одним из более распростра­ненных методов анализа флавоноидных соединений. За последнее время накоплен большой материал по УФ-спектроскопии флавоноидных соединений, с помощью которого возможна идентификация не только основной структуры флавоноидов, но и установление количества и положения гидроксильных групп и остатков сахаров.

Спектрофотометрический метод анализа базируется на избирательном поглощении монохроматического света раствором исследуемых веществ. Поглощение обусловлено электронными переходами с орбиты донорного заместителя на вакантную орбиту бензольного кольца или акцепторного заместителя.

Для флавоноидов в УФ-спектре характерны две интенсивные полосы поглощения в длинноволновой области 320-380 нм (I полоса) и в коротковолновой 240-270 нм (II полоса), а для флавонолов 350-390 нм и 250-270 нм соответственно, дополнительный максимум при 300 нм. Расстояние между основными максимумами более или менее постоянно и для флавонолов составляет 93-125 им, что может служить отличительным признаком.

Спектральные исследования спиртовых растворов флавоноидных соединений показывают, что гидроксильные группы оказывают значительное батохромное к гипсохромное влияние на максимумы поглощения в зависимости от их положений. Наибольшее влияние оказывают оксигруппы, сопряженные с карбонилом, другие группы имеют вспомогательное значение. Поэтому при снятии УФ-спектров используют различные реагенты, оказывающие влияние на хромофорную систему флавоноидов, что проявляется в виде батохромных или гипсохромных сдвигов основных максимумов поглощения. Рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые, так и коротковолновые максимумы. В качестве ионизирующих и комплексообразующих добавок достаточно широко применяют этилат натрия, ацетат натрия, ацетат натрия с борной кислотой, хлористый алюминий и хлористый цирконил с лимонной кислотой.

При наличии гидроксильной группы в положении С-7 наблюда­ется батохромный сдвиг I полосы под действием ацетата натрия.

У флавонов и флавонолов свободная гидроксильная группа в 4-положении устанавливается в присутствии этилата натрия по батохромному сдвигу первой полосы на 40-64 нм без уменьшения интенсивности. Гидроксильная группа в положении С-3 у флавонолов при отсутствии гидроксила у С-4" также вызывает батохромию первой полосы на 50-60 нм, но уже с понижением интенсивности. Если присутствуют гидроксильные группы у С-3 и С-4" одновременного наблюдается гипсохромный сдвиг, что обусловлено окислением и разрушением в щелочной среде 4"-оксифлавонолов.

Орто-диоксильная группировка в боковом фенильном радикале устанавливается по батохромному сдвигу первой полосы в присутствии безводного ацетата натрия с борной кислотой на 25 нм.

Хлористый алюминий и соли цирконила позволяют определить свободные гидроксильные группы в положении С-3 и С-5 по батохромии 1 полосы. Если при добавлении лимонной кислоты батохромный сдвиг исчезает, то что обусловлено 5-оксигруппой. Устойчивый сдвиг к лимонной кислоте оказывает на свободную гидроксильную группу в 3 положении. Свободные гидроксилы при С-3 и С-5 вызывают удвоенный батохромный сдвиг 1 полосы под действием хлористого цирконила, достигающий 100 нм и более.

Флавонолы в присутствии алюминия хлорида и соляной кислоты вызывают батохромию первой полосы на 50-60 нм, а сдвиг второй полосы на 20-26 нм.

3.3.3. ИК-спектроскопия

При анализе флавоноидных соединений широко используются спектральные исследования в ИК-области для установления и подтверждения строения молекул веществ. ИК-спектроскопия позволяет также определить конфигурацию и конформацию молекул.

ИК-спектры обусловлены колебанием атомов молекулы. При этом колебания имеют различную энергию и могут быть направлены вдоль валентной связи между атомами. Колебания всех атомов молекулы обуславливают полосы поглощения индивидуальные для данного вещества.

В основном для целей идентификации служит область "отпечатков пальцев" (1400-650 см^-1). Эта область чаще всего используется для установления подлинности путем эмперического сравнения ИК-спектров исследуемого и известного соединений.

Наличие функциональных групп в молекуле флавоноида устанавливают по характерному поглощению в определенной области спектра. Так, установлено, что в ИК-спектрах флавоноидов незамещенная карбонильная группа флаванона поглощает при 1660-1690 см^-1. Валентные колебания С=О группы Флавонолов находятся в области 1637-1650 см^-1.

Наличие в 'положении С-7 гидроксильной группы понижает частоту валентных колебаний этой группы на 15-10 см^-1. Образование водородной связи между группами C=О и ОН в положении С-5 объясняет снижение значения частоты С=О до 1640 см^-1.

Валентные колебания двойных связей проявляются в виде нескольких интенсивных полос поглощения в области 1600-1470 см^-1. Колебания СН-группы ароматических колец с двойной связью, сопряженной с С=0, проявляются в области 3130-3110 см^-1.

Свободные алифатические гидроксильные группы поглощают в интервале 3625-3600 см^-1. А фенольные гидроксилы агликона определяются в области 3300-2700 см^-1. 0Н-группы углеводных заместителей проявляются в области 3600-3300 см^-1.

С помощью ИК-спектров различают L- и В- аномеры моносахаридов и их производных. Для L-конфигурации связи C-0 характерна полоса 844 ± 8 см^-1, для L-конфигурации - полоса 891±7 см^-1. Сочетание ИК-спектроскопии с хроматографией в тонких слоях сорбента позволяет повысить избирательность качественного обнаружения веществ в смеси. Количество исследуемого соединения, которое может быть снято с тонкослойной хроматограммы, достаточно для снятия ИК-спектров малых образцов. Это позволяет использовать ИК-спектроскопию в анализе биологически активных веществ, содержание которых в растениях, как правило, невелико.

ЯМР-спектроскопия

ЯМР-спектроскопия позволяет установить структуру молекул флавоноидов, их конформационное строение и распределение электронной плотности. В сочетании с УФ- и ИК-спектроскопией дает очень ценную информацию о структуре флавоноидов.

По числу сигналов в спектре ЯМР можно определить сколько типов протонов имеется в молекуле, а по положению сигналов установить тип протонов.

Вследствие низкой растворимости гликозидов в малополярных и неполярных растворителях, используемых для получения спектров, они в большинстве случаев исследуются в виде ацетильных или триметилсилиловых производных.

При помощи ПМР-спектров можно не только быстро и точно установить положение заместителей в кольцах А и В флавоноида, но и расшифровать строение углеводного компонента, определить конфигурацию гликозидной связи, природу и конформацию углевода.