А. Цветные реакции на белки и аминокислоты
Белки — полимерные соединения, построенные из аминокислот, которые соединены между собой пептидными связями. Аминокислоты – производные карбоновых кислот, у которых три валентности a-углеродного атома всегда образованы одним атомом водорода (—H), аминогруппой (—NH2) и карбоксильной группой (—COOH). Четвертая валентность может быть образована одним атомом водорода (—Н у глицина) или группировкой атомов, называемой радикалом аминокислот (—R). В составе радикалов многие аминокислоты имеют реакционно-способные (функциональные) группы. Например:
1. Сульфгидрильная группа (—SH) у цистеина.
2. Тиометильная группа (—S–CH3) у метионина.
3. Гидроксильная группа (-ОН) у серина, треонина и тирозина.
Цель работы
Провести цветные реакции с двумя растворами (I и II)[*], один из которых содержит овальбумин (яичный белок), а другой – желатину (овальбумин содержит все 20 аминокислот, а желатина только 17), и определить, в каком растворе содержится овальбумин, а в каком – желатина.
Принцип метода
Ряд химических реактивов специфически взаимодействуют (реагируют) с функциональными группами аминокислот (как свободных, так и в составе пептидов или белков) в результате чего развивается специфическое окрашивание. Такие реакции называют цветными реакциями. Интенсивность окраски в цветных реакциях пропорциональна количеству реагирующих функциональных групп. Поэтому цветные реакции могут быть использованы для качественного и количественного определения белков, для определения присутствующих в них аминокислот или для анализа состава белков.
Так, например:
1) биуретовой реакцией определяют наличие пептидных групп в олигопептидах и в белках (универсальная для любых белков).
2) нингидриновой реакцией определяют наличие a-аминогрупп в свободных аминокислотах, а также в аминокислотах олигопептидов и белков (универсальная для любых белков).
3) ксантопротеиновой реакцией определяют наличие в белках ароматических аминокислот.
4) реакцией Фоля определяют наличие в составе белков серосодержащей аминокислоты – цистеина.
Выполнение работы
| Реакция | № пробирок | Ход определения | Окраска | Чем обусловлена реакция |
| Биуретовая | Раствор I - 5 капель, 10% NaOH - 5 капель, 1 % CuSO4 - 1 капля | |||
| Раствор II - 5 капель, 10% NaOH - 5 капель, 1 % CuSO4 - 1 капля | ||||
| Нингидри- новая | Раствор I - 5 капель, 1% раствор нингидрина в ацетоне - 2 капли, нагревают | |||
| Раствор II - 5 капель, 1% раствор нингидрина в ацетоне - 2 капли, нагревают | ||||
| Ксанто-протеиновая | Раствор I - 5 капель, конц. HNO3 - 3 капли, осторожно нагревают | |||
| Раствор II - 5 капель, конц. HNO3 - 3 капли, осторожно нагревают | ||||
| Фоля | Раствор I - 5 капель, 30 % NaOH - 5 капель, 5 % (CH3COO)2Pb - 1 капля, нагревают до кипения | |||
| Раствор II - 5 капель, 30 % NaOH - 5 капель, 5 % (CH3COO)2Pb - 1 капля, нагревают до кипения |
Студенты могут проводить указанные цветные реакции на 4-х предметных стеклах[†]:
На один край каждого стекла наносят 1 каплю раствора I, на другой – раствора II.
Биуретовая реакция. К белкам на первом стекле последовательно добавляют 1 каплю 10% NаOH и 1 каплю 1% CuSO4, аккуратно перемешивая стеклянной палочкой.
Нингидриновая реакция. К белкам на втором стекле добавляют 1 каплю раствора нингидрина. Перемешивают. Осторожно нагревают до кипения.
Ксантопротеиновая реакция. К белкам на третьем стекле добавляют 1 каплю концентрированной HNO3. Перемешивают. Осторожно нагревают.
Реакция Фоля. К белкам на четвертом стекле добавляют 1 каплю 30% NaOH и 1 каплю (CH3OO)2Pb. Нагревают до кипения.
Выводы
Заполнить таблицу, сравнить полученные окраски, определить, в каком растворе овальбумин, а в каком – желатина и обосновать этот выбор.
Б. Реакции осаждения и денатурации белков
Существуют белки растворимые и нерастворимые в воде. Коллоидные растворы белков относительно устойчивы. Эта устойчивость обусловлена тем, что белковые молекулы имеют одинаковый электрический заряд и упакованы так, что на их поверхности находится большое количество гидрофильных полярных групп. Вследствие этого вокруг белковой молекулы формируется плотная многослойная водная оболочка, называемая гидратной оболочкой. Гидрофобные радикалы аминокислот упрятаны внутрь глобулы.
Изменение зарядов белковых молекул и/или снятие гидратной оболочки приводит к агрегации белковых молекул и выпадению их в осадок. При нагревании молекулы белков денатурируют, теряют свою нативную структуру, разворачиваются, но остаются во взвешенном состоянии, что проявляется в помутнении разбавленного белкового раствора.
Реакции осаждения белков используют для экспресс обнаружения белка в биологических жидкостях (например, в моче), для получения безбелковых растворов (например, при выделении ДНК из животных тканей), при разделении белковых фракций в процессе выделения и очистки белков.
Цель работы
Провести реакции осаждения белков, используя различные воздействия.
Принцип метода
Для осаждения белка нужно лишить его стабилизирующих факторов: снять заряд, удалить гидратную оболочку или разрушить третичную структуру (денатурировать), используя различные химические реагенты или нагревание.
Выполнение работы
Используют раствор овальбумина.
| № | Реакции осаждения | Ход работы* | Наблюде-ния | Чем обусловле-на реакция |
| Нагреванием | В пробирку вносят 10 капель яичного белка (см. предыдущую работу). Нагревают. | |||
| Концентрирован-ными минеральными кислотами: азотной | В пробирку вносят 20 капель HNO3 конц. Наклоняют пробирку под углом 45о и осторожно по стенке наслаивают на кислоту 20 капель белка. Смотрят на просвет. Перемешивают. | |||
| Органическими кислотами: трихлоруксусной (ТХУ) | В пробирку вносят 10 капель белка. Добовляют 5 капель 10% раствора ТХУ. Перемешивают. | |||
| Солями тяжелых металлов: меди | В пробирку вносят 5 капель раствора белка. Прибавляют 1 каплю 7% раствора CuSO4. Перемешивают . | |||
| Солями тяжелых металлов: серебра | В пробирку вносят 5 капель раствора белка. Прибавляют 2 капли 1% раствора AgNO3. Перемешивают. | |||
| Органическими растворителями: ацетон. | В пробирку вносят 10 капель белка. Прибавляют 20 капель ацетона. Перемешивают. |
* На предметных стеклышках все реактивы наносят по 1 капле и перемешивают стеклянной палочкой
Пояснение:
1. нагревание вызывает денатурацию белка, сопровождающуюся помутнением раствора
2. минеральные и органические кислоты вызывают дегидратацию и перезарядку части белковых молекул, сопровождающуюся их денатурацией
3. тяжелые металлы вызывают денатурацию белка, что обусловлено адсорбцией тяжелых металлов на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимого комплекса
4. органические растворители снимают гидратную оболочку и понижают устойчивость белка в растворе. Но осадок выпадает только в нейтральных и слабо кислых растворах. Длительное действие органического растворителя вызывает денатурацию белка.
Выводы
Тестовые задания по теме: «Аминокислоты и простые белки»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
1. Аспарагин содержит амидную группу.
2. Наличие электрических зарядов стабилизирует белковые молекулы в растворе.
3. Ксантопротеиновая реакция характерна для циклических аминокислот.
4. Смесь свободных аминокислот дает положительную нингидриновую реакцию.
5. Высаливание белков наиболее эффективно в изоэлектрической точке.
6. Аминокислота серин содержит свободную гидроксильную группу.
7. Обладают ли валин, лейцин и изолейцин гидрофобными свойствами?
8. Все ли белки растворимы в воде?
9. Разрываются ли пептидные связи при тепловой денатурации белка?
10. Дает ли смесь свободных аминокислот положительную биуретовую реакцию?
11. Входит ли орнитин в состав природных белков?
12. Можно ли рассматривать метионин как производное масляной кислоты?
2) Выбрать один правильный ответ
| К неполярным (гидрофобным) аминокислотам относится: серин треонин лизин валин цистеин | Биуретовая реакция не дает окраски с: простыми белками дипептидами трипептидами альбуминами желатиной |
3) Найти соответствие: