Качественные реакции на белки, пептиды и аминокислоты
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
К ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ
ДЛЯ СТУДЕНТОВ 2 КУРСА
ЛЕЧЕБНОГО И ПЕДИАТРИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ
ПО БИОХИМИИ
ЧИТА-2008
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
К ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ
ДЛЯ СТУДЕНТОВ 2 КУРСА
ЛЕЧЕБНОГО И ПЕДИАТРИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТОВ
ПО БИОХИМИИ
ЧГМА-2008
ПРЕДИСЛОВИЕ
Настоящее учебное пособие создано на кафедре биологической химии с курсом клинической биохимии. Целью данного издания является
Государственный образовательный стандарт предусматривает изучение данных вопросов. У студентов 2-го курса формируется исходный уровень знаний о биохимических функциях жизненно важных соединений и регуляции метаболических процессов.
Биохимия и особенно молекулярная биология относятся к тем отраслям естественных наук, в которых накопление новых научных данных происходит особенно быстро. Поэтому оперативное создание руководств по этим дисциплинам имеет важное значение.
Пособие представляет информативное и наглядное руководство, в котором отражены биохимические аспекты некоторых патологических состояний, так как врач будущего должен знать основные метаболические процессы, лежащие в основе жизнедеятельности, и причины их нарушений при болезнях.
К настоящему времени показано, что большинство заболеваний связано с поломками в молекуле ДНК, приводящими к нарушениям функционирования метаболических путей. К сожалению, при постановке диагноза и проведения терапевтических мероприятий врачи не всегда уделяют должное внимание основным причинам, лежащим в основе возникновения болезни. Это происходит, по-видимому, вследствие недостаточной связи в изучении биохимии и последующих клинических дисциплин. Данное учебное пособие постарается восполнить этот пробел.
В пособии изложены современные представления о биохимических нарушениях при ряде патологических состояний и болезнях. Большое внимание уделено нарушениям метаболизма липидов, аминокислот, углеводов, БАВ, минерального обмена. Освещены основные подходы к диагностике и лечению этой группы заболеваний, перспективные направления их совершенствования. Использование знаний современной патобиохимии не только позволит врачам установить причинно-следственные связи в возникновении тех или иных заболеваний, но вооружит их знаниями для совершенствования методов лабораторной диагностики и оценки эффективности терапевтических мероприятий.
Методическое пособие составлено сотрудниками кафедры биохимии ЧГМА: заведующим кафедрой профессором д.м.н. Б.С.Хышиктуевым, профессором Л.П.Никитиной, доцентами к.б.н. А.Ц.Гомбоевой и к.м.н. Н.В.Соловьевой, старшим преподавателем М.П.Сошняниной, к.м.н. П.Б.Цыдендамбаевым, к.б.н. Н.С.Кузнецовой, к.м.н. З.Ц.Ринчиновым, ассистентом О.К.Плотниковой, к.б.н. М.В.Максименей.
Лабораторно-практическое занятие № 1
Тема: Биологическая химия: предмет изучения, цели и задачи. Основные разделы биохимии. Строение и биологическая роль пептидов и белков. Качественные реакции на протеины.
Цель: 1. Познакомиться с предметом биологической химии, ее целями и задачами, структурой курса биохимии, видами учебной деятельности и контроля на кафедре биохимии ЧГМА. Повторить правила по технике безопасности при работе в биохимической лаборатории.
2. На основе знаний о строении и реакционной способности протеиногенных аминокислот изучить современные представления о структуре и роли биологически важных пептидов, уровнях организации и форме белковых молекул.
Отработать методику проведения качественных реакций на белки и полипептиды.
Значение: Пептиды и белки имеют большое биологическое и медицинское значение. К пептидам относятся многие гормоны, некоторые антибиотики и противоопухолевые препараты. Белки (протеины) — это высокоорганизованные биополимеры, которые по химической природе являются полипептидами. Они играют центральную роль в процессах жизнедеятельности клеток. В количественном отношении протеины значительно преобладают над другими макромолекулами, присутствующими в живом организме. Белки выполняют множество разнообразных функций и служат теми инструментами, посредством которых генетическая информация получает свое реальное воплощение. Биологическая активность и специфичность действия пептидов и белков полностью определяется аминокислотной последовательностью. Более высокие уровни организации белковых молекул и, следовательно, их функции обусловлены первичной структурой. Анализ содержания в крови и других биологических жидкостях определенных белков и ферментов широко используется в диагностических целях.
Исходный уровень:
1. Кислотность и основность органических соединений.
2. Амино- и карбоксильные группы в молекулах органических соединений; характерные для них химические свойства.
3. Классификация и строение протеиногенных аминокислот.
4. Свойства аминокислот (оптическая активность, амфотерность, растворимость, заряд).
5. Амидные (пептидные) связи; электронное и пространственное строение пептидных групп.
6. Природа гидрофобных взаимодействий, ионных, водородных, бисульфидных связей.
7. Понятие о химической природе белков.
8. Понятие о строении и функциях мышечной, соединительной, нервной тканей; о пищеварительной, дыхательной, кровеносной, мочевыделительной системах; об анализаторах (зрительном, слуховом, обонятельном, осязательном).
Вопросы для самоподготовки
1. Белки как природные азотсодержащие биополимеры и их важнейшие функции в организме.
2. Аминокислотный состав белков, особенности строения. Классификация аминокислот по растворимости в воде, по соотношению количества карбоксильных и аминогрупп, по химической природе радикала (алифатические — разветвленные, неразветвленные; ароматические, гетероциклические; содержащие гидроксигруппу; содержащие атомы серы); по биологической значимости (заменимые и незаменимые). Примеры каждого класса кислот.
3. Образование пептидных связей на примере реакции взаимодействия аминокислот глицина, серина и метионина. Амфотерные свойства и прочность пептидной связи.
4. Конформационное строение пептидов следующего состава: цис-вал-лиз; ала-тре-про-асн. Роль пролина в образовании изгибов полипептидной цепи.
5. Многообразие белков в природе, его причины. Специфичность первичной структуры протеинов, ее роль в формировании более высоких уровней организации белковой молекулы. Физиологические последствия изменений в первичной структуре.
6. Работы Л.Полинга и Р.Кори по изучению вторичной структуры белка. Строение a-спирали; связи, её стабилизирующие; факторы, препятствующие спирализации. b-Складчатая структура, особенности ее конформационного строения, образование водородных связей в b-складчатом слое.
7. Чередование a-спирализованных и b-структурированных участков в полипептидной цепи, наличие в ней аминокислоты пролина и аморфных участков (неупорядоченная конформация) и их роль в формировании третичной структуры белка. Роль сил гидрофобного взаимодействия водородных, ионных и ковалентных (дисульфидных) связей в стабилизации третичной структуры. Понятие о доменной организации белков. Шапероны, их роль в формировании третичной структуры.
8. Четвертичная структура белка. Понятие о протомерах (субъединицах) и олигомерах. Примеры олигомерных белков. Изофункциональные белки на примере гемоглобина.
9. Макромолекулярные белковые комплексы (ферменты дыхательной цепи, синтеза высших жирных кислот и окисления пировиноградной кислоты).
10. Способность белка к специфическим взаимодействиям с различными лигандами. Комплементарность в строении лиганда и центра его связывания в белковой молекуле. Кооперативный эффект, возникающий при взаимодействии олигомерных белков с лигандами и понятие об аллостерических белках на примере гемоглобина.
11. Формы и размеры белковых молекул. Содержание белков в различных тканях и органах.
Литература
Основная:
1. Лекция по биоорганической химии «Аминокислоты, пептиды, белки».
2. Лекция по биохимии «Белки, строение, уровни организации».
3. Биологическая химия : Учебник / Е.С. Северин, Т.Л. Алейникова, Е.В. Осипов, С.А. Силаева. – М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. – С. 9 – 18.
4. Николаев А.Я. Биологическая химия. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004.— С.11-43.
5. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1998.— С. 19-22; 33-37; 49-68.
6. Ситуационные задачи по биохимии: Учебное пособие для студентов лечебного и педиатрического факультетов // Никитина Л.П., Гомбоева А.Ц., Соловьева Н.В. и др. – 2-е изд., испр. и доп. - Чита, 2003. – С. 4.
Дополнительная:
1. Биохимия / Под ред. Е.С.Северина. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2005 (2003). — С. 9-39.
2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Под ред. Е.С.Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. – С.6-22; 334-339.
3. Биохимия. Тесты и задачи: Учеб. пособие для студ. мед. вузов / Под ред. Е.С.Северина. – М.: ВЕДИ, 2005. – С.9-33.
4. Биологическая химия: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. завед / Под ред. Ковалевской. – М.: Издат. Центр «Академия», 2005. – С.5-6; 9-33.
5. Биохимия (в вопросах и ответах) (учебное пособие для студентов мед. вузов) / Т.П.Вавилова, Евстафьева О.Л. – М.: ВЕДИ, 2005. – С.5-13.
6. Щербак И.Г. Биохимия: Учебник. – СПб.: СПбГМУ, 2005. – С.9 -34.
7. Доменная организация белков. Некоторые представления о шаперонах и об их роли. (Методички для самостоятельной работы).
Лабораторная работа
Качественные реакции на белки, пептиды и аминокислоты
Наличие белков и полипептидов в растворах и биологических жидкостях доказывается с помощью биуретовой, нингидриновой, ксантопротеиновой, Фоля и некоторых других реакций. Они сопровождаются изменением окраски растворов, поэтому называются цветными.
Биуретовая реакция
Впервые эта реакция была получена для биурета, отсюда произошло ее название. Биуретовую реакцию дают любые соединения, содержащие две или более пептидных связей. Возникновение фиолетового окрашивания в присутствии гидроксида меди (II) в щелочной среде объясняется образованием хелатного комплекса между атомами, образующими пептидную группу, и ионами меди.
Ход определения
В пробирку поместите одну каплю 1% раствора сульфата меди, добавьте 10 капель 10% раствора гидроксида натрия и 5 капель 1% раствора яичного белка или плазмы крови. Пронаблюдайте за появлением фиолетового окрашивания.
Нингидриновая реакция
Нингидриновую реакцию дают любые вещества, в состав которых входят a-аминокислоты. При нагревании с раствором нингидрина они образуют соединения сиреневого цвета. Это используется в лабораторной практике не только для визуального обнаружения аминокислот, но и для их количественного исследования в хроматографической практике.
Ход определения
В пробирку поместите 5 капель 1% раствора белка, добавьте 3 капли 0,5 % спиртового раствора нингидрина и нагрейте до кипения. Через некоторое время происходит изменение окраски. Сделайте вывод о химическом составе белка.
Ксантопротеиновая реакция
Ксантопротеиновая реакция характерна для ароматических аминокислот и содержащих их полимеров, в том числе белков и пептидов. Ароматическое кольцо нитруется концентрированной азотной кислотой с образованием соединений желтого цвета. Этим объясняется появление желтых пятен на коже рук при попадании на них капель азотной кислоты. При добавлении щелочи окраска переходит в оранжевую.
Ход определения
В пробирку поместите 5 капель раствора белка и 3 капли концентрированной азотной кислоты; нагрейте. Отметьте появление жёлтого окрашивания. Прибавьте по каплям 20% раствор гидроксида натрия или аммония. Пронаблюдайте за изменением окраски. Дайте обоснование наличия ароматических аминокислот в исследуемом белке.
Реакция Фоля
Реакцию Фоля дают соединения, содержащие в молекуле меркаптогруппу, в том числе аминокислоты, включающие атомы серы, и белки. При нагревании со щелочью серосодержащие аминокислоты разрушаются с образованием сульфид-ионов, которые выпадают в осадок, взаимодействуя с ионами свинца. Осадок имеет темный цвет (черный или коричневый).
Ход определения
Поместите в пробирку 5 капель раствора белка (вместо него можно использовать кусочек ногтя или свернутый клубочком волос), прибавьте 5 капель 3% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца; прокипятите содержимое пробирки. Пронаблюдайте за изменениями; подведите итог.
Оформите отчет по работе. В протоколе укажите тему занятия, название лабораторной работы, кратко опишите принцип метода и ход определения, сделайте соответствующие выводы.