Количественное определение в крови метгемоглобина

Санкт-Петербургская государственная медицинская

Академия им. И.И.Мечникова

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ К

ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ХИМИИ

Под редакцией проф. В.А.Дадали, доц. М.Н. Смертиной

Часть 4

Тканевая биохимия

Санкт-Петербург

УДК 577.1(076.5)

Издание второе, переработанное и дополненное.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного и медико-профилактического факультетов медицинских ВУЗов, выполняющих практические занятия по курсу биологической химии. В пособии сформулирована цель и мотивация каждой темы, вопросы для самоподготовки, основная и дополнительная литература к каждой теме, этапы проведения занятия и методика проведения практической работы. После каждой темы приведены обучающие тесты с ответами, 25% занятий предложены в виде ситуационных задач, для решения которых студенты пользуются дополнительной литературой, предлагаемой на занятии.

Методическое пособие подготовлено коллективом кафедры биохимии СПбГМА им. И.И.Мечникова: Астратенковой И.В., Агафоновой О.А., Антоновой Ж.В., Бейшибаевой Ч.Р., Головановой Н.Э., Джангуловой Н.Э., Зайцевой Н.К., Ивановой Л.В., Кулеба В.А., Макаровой М.Н., Павловой Р.Н., Смертиной М.Н., Соколовой Е.А. под редакцией проф. В.А. Дадали, доц. М.Н. Смертиной.

Методическое пособие утверждено Ученым Советом Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.

ISBN 5-7243-0283-7 Коллектив авторов, 2009

1. Тема 27. ² Химия крови. Обмен хромопротеинов².

Место проведения – кафедра биохимии.

Продолжительность занятия – 180 мин.

2. Цель занятия: Изучить физико - химические свойства, химический состав и биологические функции крови. Ознакомиться с методом определения содержания билирубина в крови и подчеркнуть значение этого метода в клинических исследованиях.

Конкретные задачи.

3.1. Студент должен знать.

3.1.1. Химический состав и физико-химические свойства крови.

3.1.2. Строение гемоглобина и его производных.

3.1.3. Синтез и распад гемоглобина.

3.1.4. Диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

3.2. Студент должен уметь:

3.2.1. Пользоваться пипетками, мерной посудой, бюретками, работать на фотоэлектроколориметре.

4. Мотивация: знания и навыки приобретенные на занятии необходимы при изучении различных гигиенических и клинических дисциплин в их будущей работе в качестве врачей лечебного профиля.

5. Задание для самоподготовки:

Студенты должны изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

Основная литература:

5.1. Повторить лекционный материал по теме: обмен хромопротеинов

5.2. Использовать учебник: Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М., Медицина, 1998 г., с.77-84, 590 –593, 610 – 614, 628 – 637.

5.3. Северин Е.С. Биохимия М., ГЭОТАР-МЕД, 2003 г., с. 45-55, 273, 636-664.

Дополнительная литература:

5.3 Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В. и др. ²Клиническая биохимия², Учебное пособие, М., ²Триада-Х², 2002г. с. 148-156.

5.4. Кольман Я., Рем К.Г. ²Наглядная биохимия². М. ²Мир², 2000г., с. 194-196, 268-284.

5.5. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. ²Современная биохимия в схемах². М. ²Мир², 1984г., с. 95-101, 183-191.

5.6. Изучить материалы стенда ²Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра².

5.7. Подготовиться к проверочному контролю.

6. Вопросы для самоподготовки:

6.1. Химический состав крови.

6.2. Физико – химические свойства крови.

6.3. Классификация и функции белков крови.

6.4. Характеристика хромопротеинов (строение, свойства, функции).

6.5. Гемсодержащие белки: строение, свойства, функции.

6.6. Гемсодержащие ферменты: строение, свойства, функции. Примеры гемсодержащих ферментов.

6.7. Нормальные и патологические производные гемоглобина, механизм их образования.

6.8. Кооперативный эффект на примере оксигенации гемоглобина. Факторы, влияющие на сродство гемоглобина к кислороду.

6.9. Метгемоглобин: строение, образование, свойства, реакции восстановления.

6.10. Метгемоглобинемии: определение, классификация, лечение. Какие энзимопатии могут быть причиной метгемоглобинемий?

6.11. Гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и талассемии.

6.12. Дыхательная функция крови.

6.13.Этапы синтеза гема.

6.14. Порфирии, диагностика порфирий, классификация.

6.15. Этапы распада гемоглобина.

6.16. Что такое ²прямой² и ²непрямой² билирубин: механизмы образования, свойства.

6.17. Диагностическое значение определения ²общего билирубина² и его фракций в сыворотке крови.

6.18. Виды желтух и их дифференциальная диагностика.

6.19. Принцип метода определения билирубина в сыворотке крови.

7. Этапы занятия, контроль усвоения и распределения учебного времени.

Этапы занятия	Форма усвоения	Время
7.1.Постановка задачи. 7.2. Контроль исходного уровня знаний. 7.3.Разбор теоретического материала. 7.4. Приобретение практических навыков. 7.5. Подведение итогов занятия.	Излагает преподаватель. Тестовый контроль.   Опрос студентов, дискуссия.   Выполнение лабораторной работы. Излагает преподаватель.	5 мин.

Пример билета проверочного контроля:

1) Гемсодержащие ферменты: строение, свойства, функции. Примеры гемсодержащих ферментов.

2) Что такое ²прямой² и ²непрямой² билирубин сыворотки крови, место их образования и диагностическое значение.

Количественное определение в крови метгемоглобина

(метод Л.Э.Горна).

Цель работы:ознакомиться с методом количественного определения метгемоглобина в крови.

Мотивация:метгемоглобин образуется в результате реакции окисления железа в геме гемоглобина

HbFe⁺² + e ^¾ MetHbFe⁺³, т.е. MetHb образование идет под действием любых веществ с дефицитом e^¾. Этому способствует изменение конформации белковой части молекулы гемоглобина вследствие окисления ряда функциональных групп белка. В крови здорового человека содержание метгемоглобина не более 3%,что достигается равновесием между реакциями его образования и реакциями восстановления метгемоглобина. Из реакций восстановления наиболее значимыми являются следующие:

причем, НАДФН+Н⁺ образуется в ключевых реакциях ПФЦ

причем, НАДН+Н⁺ образуется в ключевых реакциях гликолиза.

причем, данная реакция является неферментативной. Если содержание метгемоглобина в крови превышает 3%- это называется метгемоглобинемия. Метгемоглобинемии делятся на врожденные и приобретенные. Врожденная метгемоглобинемия имеет место при энзимопатиях и гемобинозах. Энзимопатии – генетически обусловленные нарушения синтеза ключевых ферментов, участвующих в восстановлении МеtHb или ключевых ферментов ПФЦ, генерирующих восстановленный НАДФН. Гемоглобинозы делятся на гемоглобинопатии – генетически обусловленные нарушения строения белковой части Hb, возникающие в результате точечных мутаций, и талассемии – состояния развивающиеся в результате генетически обусловленного снижения синтеза какой либо из цепей Hb.

Приобретенные метгемоглобинемии делятся в зависимости от причины на эндогенные и экзогенные. Эндогенная метгемоглобинемия может возникать при различных патологических состояниях или заболеваниях, которые сопровождаются недостаточностью АОС (например: хронический энтерит, хронический гепатит, сахарный диабет и другие).

Экзогенная метгемоглобинемия возникает в случае избыточного поступления в организм человека окислителей, в том числе и лекарственных препаратов со свойствами окислителей. Так как MetHb теряет способность транспортировать О₂, метгемоглобинемия сопровождается признаками гемической гипоксии, которые обусловлены различными нарушениями в обмене веществ. Для профилактики и лечения осложнений необходимо контролировать уровень MetHb в крови.

Быстрым, нетрудоемким методом определения % содержания MetHb в крови является фотоколориметрический метод Л.Э.Горна. Этот метод удобен как для профилактического обследования людей, контактирующих с MetHb образователями, так и в гигиенических исследованиях при производственных и пищевых отравлениях некоторыми химическими соединениями (нитриты,

оксиды азота, пары нитробензола, нитроанилин, гексацианоферрат калия, хлорат калия и др.), при проведении токсикологических исследований на животных.

Принцип метода: метод основан на определении оптической плотности раствора, содержащего метгемоглобин. Метгемоглобин избирательно погло-щает свет с длиной волны 619 нм. Содержание метгемоглобина рассчитывают в процентах, принимая за 100% оптическую плотность раствора полностью окисленного (гексацианоферратом) гемоглобина. Эритроциты разрушают в аммиачной среде.

Ход работы:

В три пробирки отмеривают по 7,3 мл 0,25% раствора аммиака. В две пробирки вносят по 0,2 мл крови, взятой у крысы до затравки. Первая пробирка содержит HbO₂ (100%). Во вторую пробирку добавляют 1 каплю насыщенного раствора K₃[Fe(CN)₆], принимая ее за эталон со 100% содержанием MetHb. В третью пробирку отмеривают 0,2 мл крови крысы, отравленной нитритом натрия или другими метгемоглобинообразователями, и определяют в этой крови MetHb.

Пробы оставляют стоять в течение одного часа при комнатной температу-ре, затем растворы фотометрируют, определяя их оптическую плотность. Условия колориметрии: светофильтр красный (длина волны 610 нм), кювета - 10 мм, сравнение против воды.

Для расчета процентного содержания метгемоглобина в исследуемой пробе используют формулу:

Х% MetHb = (D MetHb оп – D HbO₂) · 100

D MetHb 100% – D HbO₂

DHbO₂ – оптическая плотность раствора, не содержащего метгемоглобин (кровь, взятая до затравки крысы);

DMetHb100%. – оптическая плотность раствора, содержащего метгемо-глобин в максимальной концентрации;

DMetHbоп – оптическая плотность раствора, содержащего метгемоглобин в неизвестной концентрации (кровь крысы, затравленной нитритом).

Лабораторная работа № 14