Определение содержания белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза
Белки – высокомолекулярные органические азотсодержащие полимеры, структурной единицей которых являются аминокислоты, и имеющие высокий уровень структурной организации, что в конечном итоге и определяет их важные биологические функции (в процессе свертывания крови, реакциях гуморального иммунитета, регуляции КЩР, устойчивости эритроцитов и лейкоцитов в кровотоке и ряд других). Современные физико – химические и иммунохимические методы исследования позволяют выявить в плазме крови более 100 белковых фракций.
В условиях клинических лабораторий для разделения белков сыворотки крови наибольшее распространение получил метод электрофореза.
Реактивы.
Амидошварц 1% раствор (1г амидошварца растворить в 100мл 2% уксусной кислоты); агар (агароза) 1,2% (к 12гр агарозы добавить 1л раствора мединало – вероналового буфера pH 8,6 при нагревании на водяной бане); буфер веронал – мединаловый pH8,6 (8,76г мединала и 1,38г веронала поместить в колбу на 1л, добавить 750мл воды; растворить при нагревании на водяной бане, довести водой до метки, при необходимости pH довести до 8,6).
Оборудование.
Штатив с пробирками, пипетки на 5 и 10 мл, предметные стекла, прибор для электрофореза, денситометр, СФ или ФЭК, термостат.
Материалы.
Сыворотка крови (или другая биологическая жидкость).
Принцип метода – различные по молекулярной массе, заряду и изоэлектрической точке в постоянном электрическом поле перемещаются с различной скоростью, что и положено в основу их разделения и последующего количественного определения.
Ход определения.
Разделение.
Провести в электрофоретической камере с крышкой, внутренние кюветы которой заполнены агаром и буферным раствором с pH 8,6. внутренние кюветы камеры залить горячим раствором агара и оставить до застывания. В наружные ввести мединал – вероналовый буферный раствор. Подготовить пластины с носителем агаром – на рамку, предварительно помещенную на горизонтальном столике, поместить предметные стекла 3*4см, залить горячим агаром с толщиной слоя 3мм, выровнять горизонтальный уровень и оставить для застывания (пузырьки воздуха, попавшие в агар, должны быть удалены до застывания). Пользоваться гелем рекомендуется не ранее, чем через сутки после заливки. В геле с помощью специального шаблона (или обломком лезвия безопасной бритвы) сделать канавки размером 5*0,3мм, агар из них удалить кусочком плотной фильтровальной бумаги (канавки не должны доходить до стекла, в то же время они должны быть такого размера, чтобы в них поместилось нужное количество (1 – 3 мкл) анализируемой белковой смеси). Хорошие результаты дает также другой способ – внесение разделяемой смеси в кусочки плотной хроматографической бумаги соответствующего размера, вставляемой в гель.
Рамку с пластинами поместить в электрофоретическую камеру. Для создания контакта между гелем кювет и агаром пластин создать перемычку путем внесения расплавленного геля.
Подготовленную электрофоретическую камеру подключить к источнику питания и проводить электрофорез (режим работы – при градиенте потенциала порядка 15V/см при 25 – 35 мА в течение 30 минут).
Фиксация и окраска.
После отключения прибора стекла с рамкой извлечь и зафиксировать в 12% растворе уксусной кислоты на этаноле в течение 12 часов, а затем 24 часа в дистиллированной воде с добавлением антисептика, с последующим отмыванием антисептика. Затем стекла завернуть в фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой и выдержать 24 часа в термостате при 37°С. По истечении времени стекла осторожно отмыть от бумаги и поместить на 2 часа в раствор амидошварца, затем пластины отмыть 10% уксусной кислотой при комнатной температуре в вертикальном положении. При этом выступают различной интенсивности окраски пятна, соответствующие определенным белковым фракциям.
Оформление работы.
Для количественного определения окрашенных фракций применяют как денситометрию, так и элюцию красителя. В последнем случае пятна вырезают и элюируют в 5мл 0,01N растворе NaOH. Интенсивность элюированной окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 595нм или на ФЭКе с зеленым светофильтром. Исходя из показателей экстинкции, строят кривую распределения фракции белков на электрофореграмме. Для каждой пробы ставят два параллельных исследования и вычисляют среднее значение. Процентное содержание фракций вычисляют по формуле Сфр=(Ефр*100)/Евсех фр
Для большей точности рекомендуется в пробирки для элюции вносить следующие количества элюирующего раствора: альбумина – 20мл, α1-глобулинов-5мл, α2-, β-, γ-глобулинов – 10мл, что делается для того, чтобы сделать более близкими величины экстинкций при фотометрировании. После фотометрирования полученные величины экстинкций умножают на соответствующий фактор – для альбумина – 4, α1-глобулина – 1, α2-, β-, γ- 2 и ставят эти величины в формулу для определения соотношения фракций.
Практическое значение.
В норме содержание белковых фракций в процентном отношении следующее: α1-глобулина – 2,5 – 5, α2-глобулина – 7 – 13, β-глобулина 8 – 14, γ-глобулина – 12 – 22, альбумина – 50 – 61.
При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержание альбуминов и возрастанием количества α-глобулинов; а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α2- и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови. При злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз) сопровождаются снижением альбуминов, которые синтезируются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов. Вследствие увеличения IgA, происходящего при некоторых формах цирроза печени, отмечается слияние β- и γ-фракций.
Методом электрофореза может быть выявлена недостаточность α1-антитрипсина. Этот белок является основным компонентом полосы α1-глобулинов и у пациентов с недостаточностью α1-антитрипсина (гомозиготных) эта полоса может быть очень неотчетливой, но у гетерозиготных пациентов полоса может казаться нормальной.
При электрофорезе иммуноглобулины ведут себя в большей степени как γ-глобулины, хотя IgA и IgM могут двигаться с β- или α2-глобулинами. Поскольку концентрация IgG в нормальной плазме существенно превышает содержание других иммуноглобулинов, полоса γ-глобулинов, получаемая при электрофорезе нормальной сыворотки, в значительной степени представлена IgG. Уменьшение или увеличение концентрации иммуноглобулинов в плазме могут иметь как физиологический, так и патологический характер.