Электрофорез в полиакриламидном геле
Не смотря на то, что в продаже имеются готовые пластины с закрепленным (чаще всего очень тонким) слоем полиакриламида, в большинстве лабораторий полиакриламидный гель готовят самостоятельно непосредственно перед опытом. Для этого смешивают маточные растворы акриламида, NN`-метиленбисакриламида (образуют поперечные сшивки меду нитями полиакриламида), тетраметилэтилендиамида ((CH3)2-N-CH2-CH2-N-(CH3)2 - ТЕМЕД – катализатор полимеризации) и инициатора полимеризации. В качестве инициатора чаще всего используют пресульфат (S2O3-) аммония или рибофлавин (в последнем случае необходимо облучение ярким дневным или ультрафиолетовым светом. Кроме того, в смеси должно быть предусмотрено наличие буферной системы (иногда мочевины, додецилсульфата натрия, детергентов и т.д.).
Концентрация акриламида и метиленбисакриламида могут варьировать в достаточно широких пределах, что позволяет готовить гели с заданными свойствами: от крупнопористых, в которых эффект молекулярного сита отсутствует, до мелкопористых, в которых разделяемые белки тормозятся за счет взаимодействия с нитями полимера. В последнем случае скорость движения молекул будет определяться не только зарядом, но и размером белковой глобулы. Иногда используют пластины с постепенно возрастающей концентрацией акриламиды, что позволяет добиться значительного улучшения разрешения.
Другими преимуществами полиакриламидных гелей являются их химическая стабильность и инертность, отсутствие адсорбции и электроосмоса, устойчивость к растворителям, изменениям температуры и рН.
Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е. электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного концентрирования.
Электрофоретическое разделение белков проводят в вертикально расположенных трубочках или пластинках (слэбах). Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то преимущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность геля.
Все приборы с вертикальным расположением гелей конструктивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением, так как верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах сочленения его с трубками или пластинами.
Для электрофореза в вертикально расположенных пластинах наибольшее распространение получили приборы, аналогичные предложенному в 1973 г. Стадиером (рис. 10).
Рис. 10. Прибор Стадиера (Studier) для электрофореза в вертикальных пластинах (объяснение в тексте)
При работе на таких приборах для получения пластины геля полимеризуемую смесь заливают в щель между двумя стеклами толщиной 5-6 мм, толщина щели между которыми может регулироваться толщиной специальных прокладок – «спейсоров». Расстояние между пластинами (то есть толщину пластины геля) задается толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров»). Прокладки шириной 10—15 мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Нижняя и боковые стороны пакета предварительно герметизуются – прокладками, смазанными силиконовой смазкой, пластилином, агарозным гелем и т.д. Герметичность должна быть очень высокой, особенно при использовании в качестве одного из компонентов смеси додецилсульфата натрия (электрофорез по Лэмли) – получаемые растворы при этом обладают очень высокой текучестью. В настоящей работе предлагается провести герметизацию одним из самых простых и быстрых способов – пробками из агарозного геля.
Верхний и нижний электродные резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между которыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера. Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Чаще для этой цели используют уплотнение с помощью резиновой прокладки.
В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично погружают в буфер нижнего резервуара, так что ее нижний торец оказывается приподнятым над дном резервуара.
Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора, подслаивая их под электродный буфер на дно каждого из карманов.
Для проведения электрофореза в трубках предназначен прибор фирмы «Реанал». Он (рис. 11) состоит из двух резервуаров для буферных растворов емкостью 1,5 л.
 |
Рис. 11.Аппарат для электрофореза в полиакриламидном геле фирмы «Реанал».
1, 2 — электродные камеры; 3 — трубки с гелем; 4 — штатив для трубок
В центре резервуаров в специальных держателях закреплены электроды. В дне верхнего резервуара имеются отверстия для стеклянных трубочек, которые укрепляются зажимными кольцами с резьбой. Для полимеризации геля тщательно вымытые трубочки фиксируют на специальной подставке из оргстекла. Герметичность сборки проверяется заранее, до заполнения их гелем.
Собранный вместе с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар электродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью нижний буфер иногда перемешивают магнитной мешалкой
Электрофорез белков в пластине полиакриламидного геля имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом в трубочках. Использование тонких пластин облегчает эффективное отведение тепла при электрофорезе. Процесс фиксации, прокраски и отмывания занимает значительно меньше времени. Использование одной пластины позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить разделение сразу нескольких (до 20) проб белка. На пластины можно наносить меньше белка, чем на цилиндрические гели. В зависимости от используемого красителя, а также от природы белка на пластине полиакриламида удается обнаружить от 5до 50 мкг белка.
Опыт 1. Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на бумаге
Материалы и оборудование: прибор для проведения электрофореза на бумаге с блоком питания, бумага хроматографическая, мединал, веронал, 0,1%-й раствор красителя амидового черного 10Б в 2%-й СН3СООН, кислота уксусная, сухожаровой сушильный шкаф, сыворотка крови.
Ход работы
Для приготовления мединал-вероналового буферного раствора (рН 8,6; ионная сила 0,1) в 500 мл воды растворить 17,52 гмединала, добавить 2,76 г веронала и, помешивая, нагреть в теплой водяной бане до растворения веронала. Затем объем раствора довести дистиллированной водой до1,0 л.
На полоске хроматографической бумаги отметить мягким карандашом на концах «+» и «-», в середине провести поперечную линию. По этой линии нанести микропипеткой 0,01 мл сыворотки крови. Полоску поместить в камеру для электрофореза так, чтобы «+» и «-» на бумаге соответствовали «+» и «-» прибора. Бумагу смочить буферным раствором с рН = 8,6. В такой же раствор погрузить электроды и концы бумаги. Камеру закрыть крышкой, подключить к электросети. Условия для электрофореза: напряжение электрического тока 400 В, сила тока 10-12 А, время разделения 1,0 ч. Затем ток отключить, снять крышку, полоску бумаги извлечь из камеры и высушить в сушильном шкафу при температуре 100-150°С, чтобы зафиксировать белки на бумаге. Окраска белковых фракций: бумагу поместить в сосуд с краской (бромфеноловый синий или амидошварц) на 5 мин, затем избыток краски смыть, опуская полоску бумаги в разбавленную уксусную кислоту до тех пор, пока промывная жидкость не будет бесцветной. На бумаге выявляется ряд окрашенных полос, соответствующих фракциям белков.
Зарисовать электрофореграмму:
Объяснить, почему электрофорез белков сыворотки крови осуществляют в среде с рН = 8,6. Обозначить белковые фракции, охарактеризовать их, используя данную таблицу.
| Название белковой фракции | рI | Средняя молекулярная масса |
| Альбумины | 4,64 | |
| α1-глобулины | 4,8 | |
| α2-глобулины | 4,8 | |
| β-глобулины | 5,4 | |
| γ-глобулины | 6,3 | 160 000 |
Опыт 2. Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на агарозном геле
Материалы и оборудование: прибор для проведения электрофореза на агарозных гелях «SE-1» с блоком питания «Эльф-2», 1%-й раствор агарозы, мединал, веронал, 0,1%-й раствор красителя амидового черного 10Б в 2%-й СН3СООН, кислота уксусная, сухожаровой сушильный шкаф, сыворотка крови.
Ход работы
Приготовление мединал-вероналового буферного раствора описано в опыте 1.
Раствор агарозы перед нанесением на пластинки его нагреть на кипящей водяной бане, пока он не станет свободным от пузырьков воздуха.
Перед началом работы необходимо внимательно ознакомиться с инструкциями по эксплуатации камеры для электрофореза «SE-1» и источника питания «Эльф-2»!
Приготовление агарозных пластинок и проведение электрофореза.Для приготовления агарозных пластинок использовать пластиковую пленку размером 125∙76 мм. Пленку уложить на заливочный столик, вставить в прорези столика гребенку на держателе (для формирования лунок для проб) и осторожно налить 30 мл расплавленного раствора агарозы. Пузырьки воздуха в агарозе необходимо вывести пипеткой на края пластины. Когда агароза застынет и образуется твердый гель, гребенку осторожно вынуть, пластину геля извлечь из заливочного столика и устанавить в электрофоретической камере прибора «SE-1». Агарозное плато соединить с буферным раствором «бумажными мостиками» из фильтровальной бумаги. В каждую лунку внести сыворотку крови, предварительно разведенную в 10 раз буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100-300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Камеру закрыть крышкой с вмонтированными проводами электропитания (строго соблюдать полярность подключения – цвет меток на камере и на крышке должны совпадать!). Прибор подключить к источнику тока «Эльф-2» (строго соблюдать полярность подключения – красный цвет провода соответствует положительной клемме на источнике питания!). Включить тумблер включения на источнике питания, который обеспечивает подачу тока, стабилизированного по напряжению (200 В). Электрофорез проводить в течение одного часа.
Обработка агарозных пластинок.После окончания электрофореза ток выключить, пластину с агарозным гелем тотчас извлечь из камеры и поместить на 20 мин в 5%-й раствор уксусной кислоты. Пластинку покрыть листом фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-м растворе СН3СООН, для удаления воды и солей и высушить при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его можно проводить при температуре 37°С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агарозной пленке, осторожно снять, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агарозное поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах провить амидовым черным 10 Б в течение ночи. Несвязавшийся с белком краситель отмыть 5%-м раствором уксусной кислоты. При необходимости дальнейшего хранения отмытые электрофореграммы можно высушить при температуре 37°С.