Опыт №1 .Распределительная хроматография аминокислот

(нисходящая хроматография).

При нисходящей хроматографии полоски хроматографической бумаги, с нанесенным раствором разделяемой смеси погружают в ванночку с растворителем, находящуюся в верхней части герметически закрывающейся хроматографической камеры. Полоска бумаги при этом свободно свисает из

ванночки, и растворитель по ней движется сверху вниз.

Ход определения. Готовят смесь из нескольких аминокислот, имеющих разные коэффициенты распределения. Можно впять следующие сочетания

аминокислот:

а) глицин - 22,7 мг, валин - 11,7 мг, гистидин солянокислый - 22,7 мг, изо лейцин - 13,1 мг;

б) аргинин солянокислый - 21,0 мг, глутаминовая кислота - 14,7 мг, аланин - 8,9 мг, метионин 14,9 мг;

в) лизин солянокислый - 18,1 мг, серии - 10,5 мг, тирозин - 9 мг, фенила ланин -15,1 мг;

г) цистин - 23,8 мг, аспаргиновая кислота - 13,3 мг, треонин ^11,9 мг, триптофан - 20,4 мг,

д) глутаминовая кислота - 14,7 мг, глицин - 7,5 мг, треонин - 11,9 мг,

Для приготавленияраствора одну из смесей растворяют в 10 мг 50%~ кого раствора муравьиной кислоты или в 10 мг дистиллированной воды, к которой добавляют несколько капель бутилового спирта

Чтобы приготовить растворитель берут 4 части бутилового спирта, одну" часть ледяной уксусной кислоты и 5 частей дистиллированной волы жидкости наливают в делительную воронку, встряхивают в течение нескольких минут и оставляет для разделения слоев. Нижний о лей сливают и используют для насыщения его парами камеры, в которой производится хроматография. Верхний насыщенный водой бутилово-уксусный слой, используют для хроматографии.

На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество растворителя, который при испарении насыщает камеру парами, что предотвращает высыхание фильтровальной бумаги. В верхней части камера укрепляют ванночку, представляющей собой стеклянную трубку соответствующую длине камеры, запаянную с концов, имеющую продольный разрез шириной 2-3 мм, и наливают в нее растворитель.

Берут полоску хрономатографическоЙ бумаги шириной 5 см и, отступая от ее края на 8-10 см, при помощи микропипетки наносят 0,005-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Образовавшееся пятно быстро просушивают над электроплиткой Коней бумаги, ближе к которому нанесена капля смеси, опускают в ванночку с растворителем, а второй конец должен свободно свисать через отверстие в ванночке в камеру. Необходимо следить, чтобы полоска бумаги свисала строго вертикально и не прикасалась свободной концом ни к стенкам, ни ко дну камеры, ни к растворителю на дне камеры. В ванночке полоса бумаги фиксируется предметным стеклом или стеклянной палочкой.

В процессе хроматографии растворитель должен пройти вдоль всей полосы бумаги, увлекая за собой аминокислоты. Когда растворитель пройдет до конца полосы, ее извлекают из камеры и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу Для лучшего разделения смеси пропускание растворителя можно повторить. Высушенную полосу опрыскивают раствором 0,5%-ного нингидрина на ацетоне с добавлением уксусной кислоты и воды (95:1:4) и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С на 10-15 чин. На высушенной полосе появляются отдельные лиловые пятна, соответствующие адсорбированныз аминокислот из взятой смеси.

Лабораторная работа по теме «БЕЛКИ»

Опыт№1: «ДИАЛИЗ БЕЛКОВ»

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлонам, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Для приготовления раствора одну из смесей растворяют в 10 мг 50%-ного раствора муравьиной кислоты или в 10 мг дистиллированной волы, к которой добавляют несколько капель бутилового спирта.

Чтобы приготовить растворитель берут 4 части бутилового спирта, одну* часть ледяной уксусной кислоты и 5 частей дистиллированной волы жидкости наливают в делительную воронку, встряхивают в течение нескольких минут и оставляет для разделения слоев. Нижний олой сливают и используют для насыщения его парами камеры, в которой производится хроматография. Верхний насыщенный. водой бутилово-уксусньш слой, используют для хроматографии.

На дно хроматографической камеры наливают небольшое количество растворителя, который при испарении насыщает камеру парами, что предотвращает высыхание фильтровальной бумаги. В верхней части камера укрепляют ванночку, представляющей собой стеклянную трубку соответствующую длине камеры, запаянную с концов, имеющую продольный разрез шириной 2-3 мм, и наливают в нее растворитель.

Берут полоску хрономатографической бумаги шириной 5 см и, отступая от ее края на 8-10 см, при помощи микропипетки наносят 0,005-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Образовавшееся пятно быстро просушивают над электроплиткой. Коней бумаги, ближе к которому нанесена капля смеси, опускают в ванночку с растворителем, а второй конец должен свободно свисать через отверстие в ванночке в камеру. Необходимо следить, чтобы полоска бумаги свисала строго вертикально и не прикасалась свободной концом ни к стенкам, ни ко дну камеры, ни к растворителю на дне камеры. В ванночке полоса бумаги фиксируется предметным стеклом или стеклянной палочкой.

В процессе хроматографии растворитель должен пройти вдоль всей полосы бумаги, увлекая за собой аминокислоты. Когда растворитель пройдет до конца полосы, ее извлекают из камеры и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу. Для лучшего разделения смеси пропускание растворителя можно повторить. Высушенную полосу опрыскивают раствором 0,5%-ного нингидрина на ацетоне с добавлением уксусной кислоты и воды (95:1:4) и помещают в сушильный шкаф при температуре 60 °С на 10-15 чин. На высушенной полосе появляются отдельные лиловые пятна, соответствующие адсорбированныз аминокислот из взятой смеси.

Лабораторная работа по теме «БЕЛКИ»

Опыт №1 :«ДИАЛИЗ БЕЛКОВ»

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлонам, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Ход определения:

В две пробирки наливают по 1 -2 мл раствора яичного белка с хлоридом натрия. В первую пробирку добавляют 1-2 капли раствора азотнокислого серебра AgN0₃, во вторую - 2 мл NaOH и 1 -2 капли CuS0₄ (т.е. проделывают биуретовую реакцию качественную реакцию на пептидную связь в мо­лекулах белка).

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка. Края мешочка зажимают "между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых палочек

Мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой, положив зажимающие его стеклянные палочки на края стакана.

Через 45 мин. после начала диализа берут две пробы наружное жидкости. С одной из них проводят биуретовую реакцию на белок, с другой - реакцию на ион хлора, добавляя 2-3 капли AgNOa.

Проделывают пробы на белок и ион хлора с жидкостью внутри мешочка.

Определяемые компоненты	До диализа	После диализа
	внешняя жидкость	внутренняя жидкость	Внешняя жидкость	внутренняя жидкость
Белок
Ион СГ				■1

В выводах отметить, какое свойство белка демонстрирует метод диализа.