Роль белков в жизнедеятельности организма. Современные представления о структуре белков
Третичная структура белка. Глобулярные и фибриллярные белки. Связи, стабилизирующие третичную структуру белков. Примеры организации третичной структуры фибриллярных белков.
Третичная структура белков — трёхмерная пространственная структура, образующаяся за счёт взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи.
Классификация белков по форме молекул
Это одна из самых старых классификаций, которая делит белки на 2 группы: глобулярные и фибриллярные. К глобулярным относят белки, соотношение продольной и поперечной осей которых не превышает 1:10, а чаще составляет 1:3 или 1:4, т.е. белковая молекула имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них, за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде. Наглядные примеры строения и функционирования глобулярных белков - рассмотренные выше миоглобин и гемоглобины.
Фибриллярные белки имеют вытянутую, нитевидную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении, и фибрин - белок свёртывающей системы крови. На примере коллагенов и эластина рассмотрим особенности строения этих белков и связь их строения с функцией.
Строение и функция эластина
В отличие от коллагена, образующего прочные фибриллы, способные выдержать большие нагрузки, эластин (также белок межклеточного матрикса) обладает резиноподобными свойствами. Нити эластина, содержащиеся в тканях лёгких, в стенках сосудов, в эластичных связках, могут быть растянуты в несколько раз по сравнению с их обычной длиной, но после снятия нагрузки они возвращаются к свёрнутой конформации.
Эластин содержит в составе около 800 аминокислотных остатков, среди которых преобладают аминокислоты с неполярными радикалами, такие как глицин, валин, аланин. Эластин содержит довольно много пролина и лизина, но лишь немного гидроксипролина; полностью отсутствует гидроксилизин.
Наличие большого количества гидрофобных радикалов препятствует созданию стабильной глобулы, в результате полипептидные цепи эластина не формируют регулярные вторичную и третичную структуры, а принимают в межклеточном матриксе разные конформации с примерно равной свободной энергией. Это как раз тот случай строения первичной структуры, когда отсутствие одной стабильной упорядоченной конформации приводит к возникновению необходимых белку свойств.
Принципы организации четвертичной структуры белков. Кооперативные изменения конформации субъединиц. Примеры реализации кооперативных эффектов.
Четвертичная структура белка-это количество и взаиморасположение полипептидных цепей Белки, состоящие из одной полипептидной цепи, имеют только третичную структуру (лизоцим, пепсин, миоглобин, трипсин).Их называют мономерами. Цепи белков соединенные ковалентными связями (например дисульфидными)поэтому инсулин мономерный белок.
Для белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей, характерна четвертичная структура.
Под четвертичной структурой понимают объединение отдельных полипептидных цепей с третичной структурой в функционально активную молекулу белка. Каждая отдельная полипептидная цепь называется протомером и чаще не обладает биологической активностью.Олигомерные белки содержат от 2(гексокиназа)до 312(пируватдегидрогеназа)пртомеров.Специфичность связывания протомеров за счет зависит от совокупности радикалов третичной структуры и определяется комплементарностью протомеров.
Комплементарность-пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей.В молекуле белка может быть несколько протомеров, которые при объединении образуют олигомер или мультимер.Для белков с четвертичной структурой характерно понятие субъединицы.Субъединица – это функционально активная часть молекулы белка. Примером белка с четвертичной структурой является гемоглобин, состоящий из 4 протомеров : 2 α и 2 β - цепей.Взаимодействие полипептидных цепей при формировании олигомера происходит за счет полярных групп аминокислотных остатков. Между полярными группами образуется ионная, водородные связи, гидрофобные взаимодействия. Активные центры возникают при образовании четвертичной структуры.В молекуле белка имеются прочные (ковалентные) связи, а также слабые, что обеспечивает с одной стороны стабильность молекулы, а с другой лабильность. Альфа спирали в протомере обозначают латинскими буквами от A до H, начиная с N конца
И экстракции белков
Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.
Методы очистки белков
Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.
Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.
На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.
Суммарный заряд белков
Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.
Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО- + Н+ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH3+с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:
-NH3+ +ОН- → -NH2 + H2O.
Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.
Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.
Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (- ). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.
Белков
На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.
Растворимость белков
Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.
ХРОМОПРОТЕИНЫ
Хромопротеины состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента. Различают гемопротеины (содержат в качестве простетической группы железо), маг-нийпорфирины и флавопротеины (содержат производные изоаллоксазина). Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и диоксида углерода, окислительно-восстановительные реакции, свето-и цветовосприятие и др.
Таким образом, хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности. Например, подавление дыхательной функции гемоглобина путем введения оксида углерода (СО) либо утилизации (потребление) кислорода в тканях путем введения синильной кислоты или ее солей (цианидов), ингибирующих ферментные системы клеточного дыхания, моментально приводит к смерти организма.
Хромопротеины являются непременными и активными участниками аккумулирования энергии, начиная от фиксации солнечной энергии в зеленых растениях и утилизации ее до превращений в организме животных и человека. Хлорофилл (магнийпорфирин) вместе с белком обеспечивает фотосинтетическую активность растений, катализируя расщепление молекулы воды на водород и кислород (поглощением солнечной энергии). Гемопротеины (железопорфирины), напротив, катализируют обратную реакцию – образование молекулы воды, связанное с освобождением энергии.
Флавопротеины содержат прочно связанные с белком простетические группы, представленные изоаллоксазиновыми производными – окисленными флавинмононуклеотидом (ФМН) и флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Флавопротеины входят в состав оксидоредуктаз – ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции в клетке. Некоторые Флавопротеины содержат ионы металлов. Типичными представителями флавопротеинов, содержащих также негемовое железо, являются ксантин-оксидаза, альдегидоксидаза, СДГ, дигидрооротатдегидрогеназа, ацил-КоА-дегидрогеназа и транспортирующий электроны флавопротеин.. Негемовое железо связывается с белковым компонентом, отличающимся от гемсодержащих хромопротеинов. Железо ковалентно связано с атомом серы остатка цистеина в белке. При кислотном гидролизе такого белка освобождается железо и H2S. Несмотря на структурные отличия от цито-хромов, негемовые флавопротеины выполняют аналогичную функцию в транспорте электронов благодаря способности переходить из окисленного в восстановленное состояние.
Гемопротеины
К группе гемопротеинов относятся гемоглобин и его производные, миоглобин, хлорофиллсодержащие белки и ферменты (вся цитохромная система, каталаза и пероксидаза). Все они содержат в качестве небелкового компонента структурно сходные железо(или магний)-порфирины, но различные по составу и структуре белки, обеспечивая тем самым разнообразие их биологических функций. Рассмотрим более подробно химическое строение гемоглобина, наиболее важного для жизнедеятельности человека и животных соединения
МЕТАЛЛОПРОТЕИНЫ
К металлопротеинам относятся
биополимеры, содержащие, помимо белка, ионы какого-либо одного или нескольких металлов
ферритин
трансферрин
гемосидерин
белки, координационно связанные с атомами металлов в составе сложных белков-ферментов, для которых металл служит или мостиком между белковым компонентом и субстратом, или, что более вероятно, металл в них непосредственно выполняет каталитическую функцию. Имеющиеся данные о некоторых ферментах, активность которых зависит от присутствия ионов металлов
Классификация ферментов
Номенклатура ферментов
1) Существует тривиальная номенклатура – названия случайные, без системы и основания, например трипсин, пепсин, химотрипсин.
2) Рабочая номенклатура – название фермента составляется из названия субстрата или продукта реакции, типа катализируемой реакции и окончание –аза, например лактатдегирогеназа.
3) Систематическая, научная - L-лактат-НАД-оксидредуктаза.
4) Все ферменты имеют цифровой шифр, например ЛДГ - 1.1.1.27.
Первая цифра говорит о типе катализируемой реакции, указывая на номер класса.
Вторая уточняет действие фермента – номер подкласса.
Третья указывает природу разрываемой связи в молекуле субстрата - подподкласс.
Четвёртая – порядковый номер фермента.
Пример аллостерической регуляции.
Аллостерические ферменты построены, как правило, из двух или большего числа субъединиц. Одна субъединица имеет каталитический центр (каталитическая субъединица), другая — регуля-торный центр (регуляторная субъединица). В отсутствие аллостерического ингибитора субстрат присоединяется к каталитическому активному центру и происходит реакция. Если в среде есть аллостерический ингибитор, он присоединяется к регуляторному центру, что ведет к изменению конформации регуляторной субъединицы; вследствие этого изменяется конформация и каталитической субъединицы, в том числе каталитического активного центра. В результате активность фермента снижается. Чем выше концентрация аллостерического ингибитора, тем больше молекул фермента блокируется им и тем меньше скорость превращения субстрата. Аналогично происходит и активация ферментов при действии аллосте-рических активаторов.Метаболический путь синтеза УТФ включает восемь реакций. Первая реакция катализируется ферментом карбамоилфосфатсинтетазой П. Продукт реакции — карбамоилфосфат — образуется из диоксида углерода, амидной группы глутамина и фосфатного остатка АТФ; АТФ служит также источником энергии. Карбамоил-фосфатсинтетаза II — это аллостерический фермент; конечный продукт метаболического пути (УТФ) является его аллостерическим ингибитором. Чем больше концентрация УТФ, тем меньше скорость первой реакции, а значит, и всех остальных реакций, поскольку для них образуется мало субстратов. Таким способом скорость синтеза УТФ уравнивается со скоростью его расходования, т. е. с потребностью клетки в этом веществе.
Иммобилизованные ферменты – это ферменты, ковалентно присоединенные к любому органическому или неорганическому полимеру.
Их преимущества в сравнении с обычными в том, что их можно многократно использовать, при этом их активность снижается незначительно. При этом обеспечивается их высокая специфичность действия и высокая стабильность.
В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме.В медицине иммобилизованные ферменты используются также как лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в различных аппаратах для перфузионной очистки различных биологических жидкостей.
20.Методы определения и единицы активности и количества фермента. Понятие об энзимопатологии, энзимодиагностике и энзимотерапии.
Для определения ферментативной активности используют следующие методы:
1. Химический метод – количественное определение субстрата или продуктов с помощью химических реагентов (О-гликозилгидролазы – по образованию восстанавливающих сахаров).
2. Спектрофотометрический метод – измерение скорости ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при характеристической длине волны (лиазы – по образованию двойной связи).
3. Манометрический метод – определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (оксидазы – по поглощению О2, декарбоксилазы – по выделению СО2).
4. Поляриметрический метод – фиксируется изменение оптического вращения (β-фруктофуранозидаза).
5. Хроматографический – количественное определение субстрата или продуктов с помощью различных видов хроматографии: бумажной (анализ сахаров), тонкослойной (гликозидов со сложными агликонами), ВЭЖХ (аминокислотный анализ и др.).
Удельная активность – это число единиц активности (Е) на мг белка.
Роль белков в жизнедеятельности организма. Современные представления о структуре белков
Белки представляют собой важнейшую составную часть пищи. Недостаток белков в пище является одной из причин повышенной восприимчивости организма к инфекционным заболеваниям. При этом снижается кроветворение, задерживается развитие растущего организма, нарушается обмен жиров и витаминов, деятельность нервной системы, печени и других органов, замедляется восстановление клеток после тяжелых заболеваний. За жизнь человека белок обновляется 200 раз.
Несмотря на огромное многообразие белковых веществ в природе, в построении нашего организма участвует лишь 22 аминокислоты, поэтому не все белки мы можем использовать в пищу.
Белки составляют важнейшую часть всех клеток и тканей живых организмов, что делает их существование без белков невозможным. Поступая в организм, белки пищи подвергаются действию ферментов и гормонов и в итоге превращаются в составляющие их аминокислоты. Аминокислоты всасываются через стенки кишечника в кровь. Часть аминокислот поступает в печень, где происходит их дальнейшие превращения, а большая часть разносится к тканям и органам, где аминокислоты расходуются на построение и обновление клеток, а также на построение и обновление ферментов и гормонов. Наконец некоторая часть аминокислот является источником энергии, главным образом, при нехватке углеводов и жиров.
Таким образом, белки являются главным материалом для построения тканей организма.
Организм человека обладает способностью образовывать нужные аминокислоты из других аминокислот. Однако имеется 8 аминокислот (триптофан, лейцин, изолейцин, валин, треонин, лизин, метионин, фенилаланин), которые организм человека не способен синтезировать, но которые входят в состав белковых веществ человека. Эти аминокислоты называются «незаменимыми», они должны поступать в организм с продуктами питания. В питании детей дошкольного возраста они должны составлять 40% от суммы аминокислот, школьного возраста – 30%, а взрослых – 16%, т.е. 13-14 г.
Кроме того, питательная ценность белков зависит от степени усвояемости их организмом. Растительные белки усваиваются хуже, чем животные: белки яиц и молока – на 96%, рыбы и мяса – на 95%, хлеба – на 85%, овощей – на 80%, картофеля и бобовых – на 70%. Растительные белки должны составлять в дневном рационе не более 40%, т.к. наиболее полноценными считаются белки животного происхождения. Причина – большинство растительных белков имеет недостаточное содержание одной или двух незаменимых аминокислот. Это в основном лизин, метеонин и цистин.
Вместе с тем следует сказать и об отрицательном влиянии избытка белка в питании. Из-за большой реакционной способности организм переносит избыток белков труднее, чем других пищевых веществ. Особенно страдают от избытка белков печень и почки. Длительный избыток белка в питании вызывает перевозбуждение нервной системы, нарушение обмена витаминов, ожирение организма, заболевание суставов. Все это связано с повышенным поступлением вместе с белками нуклеиновых кислот, накоплением мочевой кислоты – продукта обмена пуринов, превращением избытка белков в жиры и т.д.
Потребность человеческого организма в белках составляет 1,1-1,5 г в день на 1 кг массы тела человека. Основными источниками белка в питании являются мясные, рыбные и зернобобовые продукты. Больше всего белка содержится в сырах – 25%, горохе и фасоли – 22-23%, разных видах мяса, рыбы и птицы – 16-20%, жирном твороге – 14%, крупах – 12-13%, ржаном хлебе – 5-6%, пшеничном – 8%, молоке – 2,9%, овощах и плодах – не более 2%.
Структура белка.Различают 4 уровня структурной организации белков, называемых первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами
Последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи белковой молекулы получила название первичной структуры белка. Многократно повторяющаяся пептидная связь (-СО-NH) является типичной ковалентной связью, которая определяет первичную структуру белка. Первичная структура белка, помимо большого числа пептидных связей, обычно содержит также небольшое число дисульфидных (-S-S-) связей. Пространственная конфигурация полипептидной цепи, точнее тип полипептидной спирали, определяет вторичнуюструктуру белка, она представлена в основном α-спиралью, которая фиксирована водородными связями. Однако оказалось, что в растворах белка спирализованная полипептидная цепочка может принимать ту или иную конфигурацию. Эта конфигурация полипептидной спирали в пространстве определяет ее третичную структуру. третичная структура показывает, как полипептидная цепь, свернутая целиком или частично в спираль, расположена или упакована в пространстве (в глобуле).
Известная стабильность третичной структуры белка обеспечивается за счет водородных связей, межмолекулярных ван-дер-ваальсовых сил, электростатического взаимодействия заряженных групп и т д. Молекулы некоторых белков (например, гемоглобина) состоят из нескольких симметрично построенных частиц (одинаковых полипептидных цепей), обладающих одинаковой первичной, вторичной и третичной структурой. Совокупность таких одинаковых частиц (субъединиц), представляющая единое молекулярное образование в структурном и функциональном отношении, получила название четвертичной структуры белка.