Строение и свойства ферментов

Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций. Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку – энзимологию.

От неорганических катализаторов ферменты отличаются рядом характерных особенностей. Прежде всего, ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям рН среды.

Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как химической природы субстрата, так и типа катализируемой реакции. Особенностью ферментов является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне, так и посредством определенных низкомолекулярных соединений, в частности субстратов и продуктов катализируемых реакций, ингибиторов, активаторов и др.

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных соединений: амфотерностью; электрофоретической подвижностью, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности в электрическом поле. Ферменты неспособны к диализу через полупроницаемые мембраны. Как и белки, они легко осаждаются из водных растворов при низких температурах методами высаливания или осторожным добавлением ацетона, этанола и других веществ и при этом не теряют своих каталитических свойств.

Подобно белкам, ферменты имеют большую молекулярную массу – от десятков тысяч до нескольких миллионов.

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих, помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофактор), присутствие которого является абсолютно необходимым для каталитической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название холофермента (холоэнзим), а кофактор – простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента. Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом. Под коферментом часто подразумевают дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента при диссоциации.

Кофактор, который непосредственно не участвует в акте катализа, не является коэнзимом. В то же время простетическую группу можно назвать коферментом, если она непосредственно участвует в энзиматической реакции. Простетическая группа, которая не вовлечена в акт катализа, но функционально является существенным как для фермента, так и для некаталитического белка, может быть названа кофактором. Наконец, кофактор и кофермент, непрочно связанные (или слабо связанные) с ферментом или белком, тем не менее не классифицируются в качестве простетических групп.

Поскольку участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об активном центре фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рисунок 2.6).

Темные полосы - участки полипептидной цепи фермента; R - аминокислотные остатки и их порядковые номера (с N-конца) Рисунок 2.6 - Схематическое изображение активного центра фермента (по Малеру и Кордесу)

Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы.

В активном центре условно различают так называемый каталитический центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и связывающий центр, или контактную («якорную») площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом.

Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos – другой, иной и steros – пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), молекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Присоединение эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигурацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, связывающихся с аллостерическим центром, получили название аллостерических ферментов.

Отличительной особенностью ряда аллостерических ферментов является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно удаленных друг от друга. В аллостерическом ферменте каждый протомер содержит один активный центр, связывающий субстрат, и один аллостерический центр, связывающий эффектор. Получены доказательства, что для субстрата аллостерические ферменты, помимо активного центра, содержат и так называемые эффекторные центры; при связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается каталитическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффективность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, связывающими лиганды одного типа, принято называть гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды разных типов – гетеротропными взаимодействиями.

В энзиматическом катализе, как и в реакции связывания субстрата, участвует не ограниченная и небольшая часть фермента, как предполагалось ранее, а значительно большая часть молекулы белка-фермента. Этими обстоятельствами, вероятнее всего, можно объяснить большие размеры и объемность трехмерной структуры молекулы фермента. Эти же обстоятельства следует учитывать в программах создания искусственных низкомолекулярных аналогов ферментов (синзимов), обладающих свойствами нативных ферментов.

Изоферменты (изоэнзимы) — это группы или семейства ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, обладают одним и тем же типом субстратной специфичности, но отличаются друг от друга по аминокислотному составу, первичной структуре белка, молеку­лярной массе, а также по некоторым физико-химическим свойствам (электрофоретической подвижности, оптимуму рН, термостабильно­сти, сродству к субстрату, чувствительности к ингибитору).

Изоферменты являются олигомерными белками, построенными из нескольких протомеров. Между собой изоферменты различаются на уровне четвертичной структуры. К энзимам, имеющим несколько мо­лекулярных форм, относятся лактатдегидрогеназа (ЛДГ), креатинфосфокиназа (КФК), альдолаза, малатдегидрогеназа, холинэстераза и мн. др. Например, КФК является димером и имеет три изофермента: КФК₁ (ВВ) — изофермент, характерный для мозга; КФК₂ (MB) — для миокарда; КФК₃ (ММ) — для скелетной мышцы.

Мультимолекулярные ферментные системы (мультиферменты) включают несколько ферментов, каждый из которых катализирует отдельную стадию многостадийного процесса в организме. Простран­ственное объединение нескольких последовательных реакций в мультиферментном комплексе имеет ряд преимуществ по сравнению с катализом отдельными ферментами: предотвращаются конкурентные реакции; последовательные реакции согласованы; промежуточные продукты не выделяются в цитоплазму; реакция протекает эффектив­но благодаря высокой концентрации субстрата при незначительных потерях за счет диффузии.

Примером мультиферментной системы является пируватдегидро-геназный комплекс, катализирующий превращение пирувата в ацетил-КоА. Он включает три фермента (пируватдегидрогеназу, дигидроли-поилацетилтрансферазу, дигидролипоилдегидрогеназу) и пять кофер-ментов (тиаминпирофосфат, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД⁺, НАД⁺).

Классификация ферментов.Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве. Комиссией были рассмотрены 3 принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения.

Первый принцип – химическая природа фермента, т.е. принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфатпротеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только лишь для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению.

Второй принцип – химическая природа субстрата, на который действует фермент. По этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и огромное количество промежуточных продуктов обмена.

В основу принятой классификации положен третий принцип – тип катализируемой реакции, который является специфичным для действия любого фермента.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы) (таблица 2.2).

Оксидоредуктазы.К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД⁺ оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы.

Таблица 2.2 – Основные классы ферментов и типы катализируемых ими реакций

Класс ферментов	Тип катализируемой реакции
Оксидоредуктазы	Окислительно-восстановительные реакции всех типов
Трансферазы	Перенос отдельных атомов или групп атомов от донора к акцептору
Гидролазы	Гидролитическое ращепление химических связей
Лиазы	Негидролитичесое расщепление двойных связей или их образование
Изомеразы	Реакции взаимопревращения изомеров
Лигазы (синтетазы)	Соединение двух молекул и образование связей С—С, С—О, С—S и С—N, сопряженных с разрывом пирофосфатной связи АТФ

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы.К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор: транспортируемая группа – трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др.

Например: метил- и формилтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.

Гидролазы.В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды. Наименование их составляют по форме «субстрат-гидролаза». К ним относятся: эстеразы – ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза сложных эфиров; гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей; фосфатазы и пептидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей; амидазы, ускоряющие разрыв амидных связей, отличных от пептидных, и др.

Лиазы.К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Ферменты обозначают термином «субстрат-лиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематическое название «L-малат-гидролаза») катализирует обратимое отщепление молекулы воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.

Изомеразы.К классу изомераз относят ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров. Систематическое название их составляют с учетом типа реакции: «субстрат – цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутримолекулярный перенос группы, фермент получает название «мутаза».

К этому же классу относят рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные; внутримолекулярные оксидоредуктазы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз; внутримолекулярные трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т.д.

Лигазы (синтетазы).К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляют по форме «X : Y лигаза», где X и Y обозначают исходные вещества (например, L-глутамат: аммиак лигаза или глутаминсинтетаза, катализирующая синтез глутамина из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ).

Код каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и составляется по определенному принципу. Первая цифра указывает номер одного из шести главных классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на природу той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз – на тип гидролизуемой связи и т.д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (подподклассы), отличающиеся природой химических соединений доноров или акцепторов, участвующих в данной подгруппе реакций. Номер (цифру) подподкласса ставят на 3-е место в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз – тип отщепляемой группы и т.д. Первые 3 цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставят на 4-е место в шифре.

Свойства ферментов.К ферментам применимы три основных критерия, характерных и для неорганических катализаторов. Во-первых, они остаются неизмененными после реакции, т.е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми молекулами субстрата. Во-вторых, ферменты способны оказывать действие в очень малых концентрациях. И, наконец, наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализатора не оказывает влияния на величину константы равновесия и свободной энергии (ΔG). Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система приближается к термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равновесия. Химические реакции с высокой константой равновесия и отрицательной величиной ΔG принято называть экзергоническими. Реакции с низкой константой равновесия и соответственно положительной величиной ΔG (они обычно не протекают спонтанно) называются эндергоническими. Для начала и завершения этих реакций необходим приток энергии извне.

Поскольку ферменты явля­ются макромолекулами белковой природы, важное значе­ние для их функций имеет первичная структура, определяющая тип катализируемых реакций. Для проявления каталитического действия большое значение имеет также нативность высших белковых струк­тур. Обратимая денатурация является фактором подавления или восста­новления ферментативной активности. Молекулярные массы ферментов лежат в пределах от 10 до 1000 кДa и более.

Специфичность действия. Способность того или иного фермента катализировать пре­вращение определенного вещества (субстрата) зависит от природы как фер­мента, так и субстрата. Высокая стереоспецифичность ряда ферментов обусловлена комплементарным присоединением субстрата к ферменту в процессе каталитической реакции. Это особенно ярко проявляется в процессе реакций, характерных для L- или D-форм субстрата.

Кроме стереохимической, вы­деляют абсолютную и относительную специфичность действия ферментов.

Фермент, обладающий абсолютной субстратной специфичностью, имеет лишь один субстрат и катализирует его превращение (например, реакция образования мочевины при участии фермента аргиназы).

На скорость ферментативной реакции влия­ет не только природа атакуемой связи, но и ее окружение, а также длина угле­родной цепи субстрата. Это особенно характерно для ферментов, проявляю­щих относительную, или групповую, специфичность.

Фермент, обладающий групповой специфичностью, может катали­зировать один и тот же тип реакции с разными субстратами. Фермен­ты класса гидролаз обладают групповой субстрат­ной специфичностью. Так, например, протеазы осуществляют гидро­лиз пептидных связей в белках (пепсин, трипсин), липазы — гидролиз сложноэфирных связей в липидах (фосфолипазы), гликозидазы — гидролиз гликозидных связей в углеводах.

Термолабильность ферментов.Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10 °С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10°С. Этот показатель получил название температурного коэффициента. Вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45–50 °С, скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50 °С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекращению ферментативного процесса (рисунок 2.7).

Рисунок 2.7 - Зависимость скорости ферментативной реакции

от температуры

При температуре 100 °С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляет миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100 °С). При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, однако активность их падает почти до нуля.

Зависимость активности ферментов от рН среды.Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в процессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0–8,0. При графическом изображении на кривой колоколообразной формы имеется определенная точка, в которой фермент проявляет максимальную активность. Эту точку называют оптимумом рН среды для действия данного фермента.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NH₂-группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента, ионизации или деионизации активного центра, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации. Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции.

Ео, Ек — энергия активации реакции без и в присутствии катализатора; DG — разность свободной энергии реакции Рисунок 2.8 - Основное и переходное состояния реагирующих веществ

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями: за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры) или снижения энергии активации соответствующей химической реакции (рисунок 2.8).

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса. Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1) соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S ® E-S;

2) образование активированного переходного состояния: Е-S ® (ES)*;

3) высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* ® Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы»). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов — абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;

2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;

3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ.

Кинетика ферментативных реакций.Кинетика изучает скорости, механизмы реакций и влияние на них таких факторов, как концентрации ферментов и субстратов, темпера­тура, рН среды, присутствие ингибиторов или активаторов.

При постоянной концентрации субстрата скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента (рисунок 2.9, а). График зависимости скорости ферментативной реакции от кон­центрации субстрата имеет вид равнобочной гиперболы (рисунок 2.9, б).

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается уравнением Михаэлиса — Ментен:

,

где V — стационарная скорость биохимической реакции; V_max — максимальная скорость; К_m — константа Михаэлиса; [S] — концен­трация субстрата.

а

б

Рисунок 2.9 - Зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации фермента (а) и субстрата (б)

Если концентрация субстрата низкая, т. е. [S] << К_m, то [S] в знаменателе можно пренебречь.

Тогда .

Таким образом, при низких концентраци­ях субстрата скорость реакции прямо пропор­циональна концентрации субстрата и описы­вается уравнением первого порядка. Это со­ответствует начальному прямолинейному уча­стку кривой V = f[S] (рисунок 2.9, б).

При высоких концентрациях субстрата [S] >> К_m, когда К_m можно пренебречь, уравнение Михаэлиса — Ментен приобретает вид

, т.е. V=V_max.

Таким образом, при высоких концентрациях субстрата скорость реакции стано­вится максимальной и описывается уравнением нулевого порядка. Это соответствует участку кривой V =f [S], параллельному оси абсцисс.

При концентрациях субстрата, численно сравнимых с констан­той Михаэлиса, скорость реакции возрастает постепенно. Это вполне согласуется с представлениями о механизме ферментативной реак­ции:

k₁ k₃

S + Е ES Р + Е

k₂

где S — субстрат; Е — фермент; ES — фермент-субстратный комп­лекс; Р — продукт; k₁ — константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k₂ — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием исходных реагентов; k₃ — константа скорости распада фермент-субстратного комплекса с обра­зованием продукта.

Скорость превращения субстрата с образованием продукта (Р) про­порциональна концентрации фермент-субстратного комплекса [ES]. При малых концентрациях субстрата в растворе имеется некоторое число свободных молекул фермента (Е), не связанных в комплекс (ES). Поэтому при увеличении концентрации субстрата концентрация ком­плексов растет, следовательно, растет и скорость образования продук­та. При больших концентрациях субстрата все молекулы фермента связаны в комплекс ES (явление насыщения фермента), поэтому даль­нейшее повышение концентрации субстрата практически не увеличи­вает концентрацию комплексов и скорость образования продукта остается постоянной.

Таким образом, становится ясен физический смысл максимальной скорости ферментативной реакции. V_mах — это скорость, с которой реагирует фермент, полностью существующий в виде фермент-суб­стратного комплекса.

Константа Михаэлиса численно соответствует такой концентра­ции субстрата, при которой стационарная скорость равна половине максимальной (см. рисунок 2.9, б). Данная константа характеризует кон­станту диссоциации фермент-субстратного комплекса:

.

Физический смысл константы Михаэлиса в том, что она характе­ризует сродство фермента к субстрату. К_m имеет малые значения, когда k₁ >(k₂ + k₃), т.е. процесс образования комплекса ES преоб­ладает над процессами диссоциации ES. Следовательно, чем меньше значения К_m, тем сродство фермента к субстрату больше. И, наобо­рот, если К_m имеет большое значение, то (k₂ + k₃) > k₁ и процессы диссоциации ES преобладают. В этом случае сродство фермента к субстрату небольшое.

Ингибиторы и активаторы ферментов. Ингибиторами ферментов называются вещества, снижающие активность ферментов. Любые денатурирующие агенты (например, соли тяжелых металлов, кислоты) являются неспецифическими ингибито­рами ферментов.

Обратимые ингибиторы — это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом. Необратимые ингибиторы — это соединения, специфически связывающие функциональные группы активного центра и образующие ковалентные связи с ферментом.

Обратимое ингибирование разделяют на конкурентное и неконку­рентное. Конкурентное ингибирование предполагает структурное сход­ство ингибитора и субстрата. Ингибитор занимает место в активном центре фермента, и значительное количество молекул фермента ока­зывается блокировано. Конкурентное ингибирование можно снять, если повысить концентрацию субстрата. В этом случае субстрат вы­тесняет конкурентный ингибитор из активного центра.

Обратимое ингибирование может быть неконкурентным в отноше­нии субстрата. В этом случае ингибитор не конкурирует за место присоединения к ферменту. Субстрат и ингибитор связываются с раз­ными центрами, поэтому появляется возможность образования комп­лекса IE, а также и тройного комплекса IES, который может распа­даться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комп­лекс ES.

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на спе­цифические и неспецифические.

Специфические ингибиторы оказывают свое действие на фермент, присоединяясь ковалентной связью в активном центре фермента и выключая его из сферы действия.

Неспецифическое ингибирование предполагает воздействие на фер­мент денатурирующих агентов (солей тяжелых металлов, мочевины и др.). В этом случае в результате разрушения четвертичной и третич­ной структуры белка происходит потеря биологической активности фермента.

Активаторы ферментов — это вещества, увеличивающие скорость фермен­тативной реакции. Чаще всего в качестве активаторов выступают ионы метал­лов (Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺ и т.д.). Различают металлы, находящиеся в составе металлоферментов, являющиеся кофакторами, и вы­ступающие в качестве активаторов ферментов. Кофакторы могут прочно связы­ваться с белковой частью фермента, что же касается активаторов, то они легко отделяются от апофермента. Такие металлы являются обязательными участника­ми каталитического акта, определяющими активность фермента. Активаторы уси­ливают каталитическое действие, но их отсутствие не препятствует протека­нию ферментативной реакции. Как правило, металл-кофактор взаимодейству­ет с отрицательно заряженными группировками субстрата. Металл с переменной валентностью принимает участие в обмене электронов между субстратом и ферментом. Кроме того, они принимают участие в образовании ста­бильной переходной конформации фермента, что способствует более быстро­му образованию ES комплекса.

Регуляция активности ферментов. Одним из основных механизмов регуляции метаболизма служит регуляция активности ферментов. Одним из примеров является аллостерическая регуляция, регуляция посредством активаторов и ингибиторов. Часто бывает так, что конечный продукт метаболического пути является ингибитором регуляторного фермента. Такой тип ингибирования называется ретроингибированием, или ингибированием по принципу отрицательной обратной связи.

Многие ферменты вырабатываются в виде неактивных предше­ственников-проферментов, а затем в нужный момент активируются за счет частичного протеолиза. Частичный протеолиз — отщепление части молекулы, которое приводит к изменению третичной структуры белка и формированию активного центра фермента.

Некоторые ферменты-олигомеры могут изменять свою активность за счет ассоциации - диссоциации субъединиц, входящих в их со­став.

Многие ферменты могут находиться в двух формах: в виде про­стого белка и в виде фосфопротеида. Переход из одной формы в дру­гую сопровождается изменением каталитической активности.

Скорость ферментативной реакции зависит от количества фермента, которое в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада. Этот способ регуляции скорости ферментативной реакции является более медленным процессом, чем регуляция активности фер­мента.