Хроматографический количественный анализ
Для проведения количественного анализа широкое применение нашли хроматографические методы, осуществляемые в автоматическом режиме: газовая, газо-жидкостная, жидкостная и др. виды хроматографии. Прибор для проведения хроматографического процесса называют хроматографом.
| Подача подвиж-ной фазы | → | Ввод образца (дозатор) | → | Разделение (хроматог-рафичес-кая колонка) | → | Обнару-жение (детектор) | → | Обработка данных (ЭВМ, дисплей и др.) |
Блок – схема хроматографа.
Показания детектора отражают ход хроматограммы. Она представляет собой ряд пиков, принадлежащих различным исследуемым компонентам.
На хроматограмме различают:
1 – нулевая линия; 2 – пик несорбирующегося компонента; 3 – пик исследуемого компонента.
Основной характеристикой при идентификации компонентов является время удерживания (tR), оно обозначает время, в течение которого вещество проходит от момента ввода его в колонку до момента появления максимума пика.
Для количественного определения ведут измерения высоты пика (h) или его площади(S). Sпика=h·μ0,5; где μ0,5 – ширина пика на середине его высоты. Затем строят калибровочный график зависимости h или S от концентрации определяемого компонента. По полученному графику методом экраполяции или методом внутреннего стандарта определяют концентрацию вещества.
Для проведения хроматографического процесса используют различные сорбенты, в зависимости от природы определяемого компонента. Неполярные сорбенты: активированные угла, тефлон, полисорб и др. полярные сорбенты: силикагели, оксид алюминия и др.
Детектор хроматографа это прибор, предназначенный для регистрации аналитического сигнала.
Основные типы детекторов: пламенно – ионизационный, термохимический, катарометр, термоионный, пламенно – фотометрический электронозахватный детектор и др.
РАБОТА № 17
Анализ смеси полисахарида и нитрата кобальта методом
гельхроматографии
Гельхроматография – метод разделения высокомолекулярных веществ при пропускании их растворов через желеобразный адсорбент (гель), получаемый из сухих гранул так называемых “молекулярных сит”.
В процессе хроматографирования в колонке многократное повторение сортировки молекул по размеру в итоге приводят к разделению и вымыванию веществ в порядке убывания их молекулярных масс. Например, полисахаридный гель “Сефадекс”, марки “g - 25” Швеция, удерживает в своих порах вещества с молекулярной массой до 5000, не задерживая более крупные. Чистота разделения, т.е. присутствие в отдельных порциях элюента на выходе из колонки лишь одного вещества, может быть определена различными видами современного химического и физико-химического анализа.
Применяемый в настоящей работе метод спектрофотометрии заключается в определении светопоглощения. Степень светопоглощения, а значит и оптическая плотность раствора может быть измерена на спектрофотометре. Так как полисахариду голубому декстрану, выходящему из хроматографической колонки первым, присуще характерное излучение с длиной волны “λ” = 280 нм, то измерение оптической плотности фракции и его раствора необходимо проводить в ультрафиолетовой области спектра на спектрофотометре. Здесь частота “σ” сигнала характеризует присутствие вещества, а интенсивность “сигнала” – его количественное содержание (концентрацию раствора).
2 – ой компонент разделяемой смеси Co(NO3)2 можно обнаружить в последующих фракциях по высокой электропроводности раствора сильного электролита, содержащего нитрат-ион. Присутствие Co(NO3)2 в элюате можно подтвердить обычными химическими пробами на ионы Co2+ (см. качественный анализ).
Выполнение работы
Приборы: 1. Коллектор хроматографических фракций с дозатором объема фракции по времени или по числу капель. 2. Перистальтический насос для перекачки (с заданной скоростью) выходящего из колонки элюента к коллектору. 3. Штатив для колонки. 4. Спектрофотометр. 5. Кондуктометр.
Посуда: 1. Стеклянная хроматографическая колонка, длиной 20-25 см, диаметром 1,5-2 см. 2. Резиновая пробка с ниппелем и зажимом.3. Стеклянный стакан на 200 см3.4. Стеклянная пипетка на 10 см3. 5. Промывалка для дистиллированной воды. 6. Пробирки к коллектору для сбора фракций – 20 шт.
Реактивы: 1. Адсорбент – набухший в воде полисахаридный гель, в объеме 100 см3. 2. 1% раствор AgNO3 в объеме ~ 5 см3. 3. Исследуемый образец водный раствор смеси полисахарида (голубого декстрана) и нитрата кобальта в объеме ~ 5 см3. 4. Фильтровальная бумага.
Гельхроматографическое разделение исследуемой смеси.
Вымытую стеклянную колонку плотно закрывают с нижнего конца резиновой пробкой с ниппелем в ней и устанавливают в штативе.
Во избежание просачивания геля пробирку изнутри накрывают кружочком фильтровальной бумаги. Вначале заполняют колонку на 1/3 высоты дистиллированной водой, а затем постепенно вливают из стакана набухший в воде гель адсорбента на 3 см. ниже верхнего отверстия и закрывают ниппель зажимом.
Подготовленный для разделения раствор смеси осторожно наносят пипеткой на обнажившийся верхний слой адсорбента и присоединяют к нижнему отверстию ниппеля полиэтиленовый шланг, идущий к перистальтическому насосу и далее к коллектору фракций.
Дождавшись полного впитывания нанесенного на адсорбент раствора через верхнее отверстие осторожно наносят пипеткой 2-3 см3 дистиллированной воды и включают насос на нужный режим элюирования. Затем верхнее отверстие колонки соединяют резиновым шлангом с резервуаром, наполненным дистиллированной водой и далее весь процесс идет уже автоматически.
Перемещение голубого кольца декстрана вниз по колонке хорошозаметно. Весь процесс разделения смеси полисахарид – нитрат кобальта при заданной скорости элюирования занимает 40-50 мин, за которые в коллектор собирается 15 фракций, т.е. 1 фракция за 3 минуты.
Каждую из фракций анализируют спектрофотометрически на присутствие полисахарида, и кондуктометрически на присутствие нитрата кобальта.