Физико-химические свойства белков
Белки
Методические указания к лабораторному практикуму
по дисциплине ”Биохимия» для студентов специальностей
49 01 01 “Технология хранения и переработки растительного сырья”
49 01 02 “Технология хранения и переработки животного сырья”
91 0101 “Производство продуктов и организация общественного
питания”
Могилев 2003
УДК 557.1
Рассмотрены и утверждены
на заседании кафедры ХТВМС
Протокол № 10 от 20 мая 2003 г.
Составители: доц. О.Н.Макасеева
ст. препод. О.В.Дудинская
асс. Л.М.Ткаченко
Рецензент доц., к.т.н. Т.М.Тананайко
Редактор Т.Л. Бажанова
Технический редактор А.А.Щербакова
¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
Подписано в печать_____________ Формат 60х84 1/16
Печать офсетная. Усл. печ. л _________ Уч.-изд. л _________
Тираж _____ экз._______Заказ ______ Бесплатно
Лицензия № 226 от 12.02.2003г.
¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
Отпечатано на ризографе МГУП
212027, г. Могилев, пр. Шмидта, 3
Ó Могилевский государственный университет продовольствия
Содержание
1 Общие указания к методике выполнения и защиты лабораторных работ. 4
2 Цветные реакции на белки. 4
2.1 Биуретовая реакция. 5
2.2 Нингидриновая реакция. 6
2.3 Ксантопротеиновая реакция. 7
2.4 Реакция Адамкевича. 8
2.5 Реакция Фоля. 9
3 Физико-химические свойства белков. 10
3.1 Определение изоэлектрической точки белков. 10
3.2 Высаливание белков сульфатом аммония. 11
3.3 Необратимое осаждение белков. 12
3.3.1 Осаждение белков органическими веществами. 12
3.3.2 Денатурация белков при нагревании. 13
3.3.3 Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. 14
3.3.4 Осаждение белков органическими кислотами. 14
3.3.5 Осаждение белков солями тяжелых металлов. 14
3.4 Разделение и очистка белков методом диализа. 15
4 Методы определения азота в биологических объектах. 17
4.1 Количественное определение общего азота по методу Къельдаля. 17
4.2 Определение различных форм азота в молоке и сыре. 21
4.2.1 Метод определения общего количества азота в сыре. 23
4.2.2 Метод определения общего количества растворимого азота. 24
4.2.3 Метод определения азотосодержащих небелковых соединений. 25
4.2.4 Метод определения аминного азота (пептиды, аминокислоты, амиды, аммиак) 25
4.3 Определение белка в молоке по Лоури. 26
5 Определение влажности весовым методом. 28
5.1 Метод высушивания до постоянной массы.. 28
5.2 Определение влажности ускоренным методом высушивания. 29
5.3 Определение влажности экспрессным методом высушивания. 29
6 Нуклеопротеиды.. 30
6.1 Гидролиз нуклепротеидов дрожжей. 31
Список используемых источников. 33
1 Общие указания к методике выполнения
и защиты лабораторных работ
Перед выполнением лабораторных работ студенты должны самостоятельно изучить теоретический материал соответствующих тем курса, используя рекомендуемую литературу, оформить первых два раздела отчета – «Теория» и «Методика». В разделе «Теория» приводятся основные положения, формулировка теорий и гипотез, уравнения химических реакций с написанием структурных формул, в разделе «Методика» – принципы и изложение метода.
К работе допускаются студенты, выполнившие эти требования и ознакомленные с оборудованием и приборами, знающие свойства используемых химических реагентов и образуемых продуктов реакции в ходе эксперимента.
Во время выполнения работы проводятся соответствующие наблюдения над объектами исследования. В лабораторном журнале отмечаются физические и физико-химические эффекты, сопровождающие химические взаимодействия, делаются расчеты, составляются таблицы и рисунки, формулируется результат, что определяет содержание третьего раздела отчета «Наблюдение и результаты». В последнем разделе студенты делают выводы на основании полученного результата и знания теории.
Записи выполняются четко и аккуратно, без сокращений, за исключением принятых, оставляются поля. До ухода с занятий отчет представляют на подпись преподавателю. Защита проводится в соответствии с графиком выполнения и защиты лабораторных работ.
Цветные реакции на белки
Присутствие белка в биологических объектах или растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, которые обусловлены наличием аминокислот в белке, их специфическими группами или пептидными группами.
Существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки (биуретовая и нингидриновая). Кроме того, имеются специфические реакции, которые обусловлены наличием определенных аминокислот в молекуле белка. На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических анализах.
В данной работе студент должен не только провести универсальные и специфические реакции на белки, но и сделать вывод о питательной ценности исследованных белков, которая определяется содержанием незаменимых аминокислот.
Незаменимых (обязательных) аминокислот для человека восемь: валин (Вал), лейцин (Лей), изолейцин (Иле), треонин (Тре) , метионин (Мет), лизин (Лиз) , фенилаланин (Фен),триптофан (Трп). Две аминокислоты являются частично незаменимыми – это аргинин и гистидин. Они не синтезируются в организме детей. Эти аминокислоты, как и все другие, синтезируют микроорганизмы и зеленые растения, но не могут синтезироваться в организме животного и человека, т.к. нет аналогов соответствующих кетокислот, необходимых для их биосинтеза. Незаменимые аминокислоты должны быть обязательно введены в организм человека или животного с пищей. Если их будет в пище недостаточно, то нормальное развитие и жизнедеятельность организма нарушаются, т.к. не могут синтезироваться белки, содержащие их.
Отдельные пищевые белки могут быть биологически неполноценными по своему аминокислотному составу. Однако необходимо исследовать аминокислотный состав не отдельных белков, а всего их комплекса, содержащегося в пищевом продукте. Только при таком подходе могут быть получены правильные данные об аминокислотном составе, а следовательно, и о пищевой ценности продукта. Для питания большое значение имеет сбалансированность аминокислотного состава белков.
По содержанию в белке незаменимых аминокислот, определяемых химическими методами, вычисляют аминокислотный скор, которым характеризуют биологическую ценность белка. В продукте определяют содержание каждой незаменимой аминокислоты. Найденное количество вычисляют в процентах к содержанию той же аминокислоты в идеальном белке (куриного яйца, молока). Чаще всего в качестве идеального белка применяют аминокислотную шкалу Комитета ФАО/ВОЗ (ФАО-Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН – межправительственная организация, специализированное учреждение ООН. ВОЗ- Всемирная организация здравоохранения).
Аминокислотный скор каждой незаменимой аминокислоты в идеальном белке (шкале ФАО/ВОЗ) принимают за 100%.
Расчет аминокислотного скора ведут по формуле
B
АK = ¾¾¾¾ × 100, (1)
C
где АK – аминокислота;
В - содержание (мг) незаменимой аминокислоты в 1 г исследуемого белка;
С – содержание (мг) этой же незаменимой кислоты в 1 г идеального белка (шкале ФАО/ВОЗ).
По вычисленному скору определяют лимитирующую биологическую ценность изучаемого белка. Аминокислота с наименьшим скором является дефицитной в данном белке. Для растительного белка чаще всего дефицитным является лизин, триптофан, метионин и треонин. Белки животного происхождения – мяса, молока, яиц – биологически более ценные, т.к. их аминокислотный состав ближе к аминокислотному составу органов и тканей.
Биуретовая реакция
Принцип метода. В щелочной среде в присутствии солей меди растворы белка приобретают фиолетовый цвет с красным или синим оттенком, зависящим от количества пептидных связей в молекуле. Продукты неполного гидролиза белка, содержащие не менее двух пептидных связей, дают биуретовую реакцию с красным оттенком. Реакция обусловлена наличием пептидных групп, которые в щелочной среде образуют с ионами двухвалентной меди окрашенные комплексы.
В щелочной среде пептидная группа присутствует в своей таутомерной енольной форме:
Ион меди взаимодействует с отрицательным зарядом диссоциированной в этих условиях ОН-группой – возникает солеобразная связь; кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Комплексное соединение меди с енолизованными пептидными группами при участии четырех атомов азота можно представить следующим образом:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 10%-ного раствора NаОН и по одной капле 1%-ного раствора сульфата меди. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Развивается фиолетовое окрашивание с соответствующим оттенком.
Нингидриновая реакция
Принцип метода. Белки, полипептиды, как и свободные a-аминокислоты, дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином (гидрат трикетогидриндена). Реакция характерна для a-аминогрупп аминокислот.
На I стадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования (образование NН3) и декарбоксилирования (образование СО2) a-аминокислот: 
Окисленный Восстановленный
нингидрин нингидрин
На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570нм) пропорциональна количеству аминокислоты:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 0,5%-ного раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 минуты в пробирках появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.
Ксантопротеиновая реакция
Принцип метода.При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты белок выпадает в осадок, который при нагревании растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. Эта реакция характерна для ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофона), которые подвергаются нитрованию:
Нитропроизводное аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет. Например:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. Затем в пробирки добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и нагревают (осторожно!). При нагревании раствор и выпавший белый осадок или муть от свернувшегося белка окрашиваются в ярко-желтый цвет при наличии ароматических аминокислот: в пробирке с желатином появляется едва заметное бледно-желтое окрашивание (обусловленное незначительной примесью других белков). Пробирки охлаждают, после этого в них осторожно добавляют по 10 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия. Выпавший в начале осадок белка растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.
Реакция Адамкевича
Принцип метода. При добавлении к раствору белка небольших количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание. Эта реакция характерна для триптофана, который в кислой среде вступает в реакцию с альдегидами с образованием окрашенных продуктов конденсации. Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, которая всегда содержит следы глиоксиловой кислоты:
Ход работы. В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 2–3 капли глиоксиловой кислоты и по 5 капель ледяной уксусной кислоты. Раствор слегка нагревают, охлаждают и по стенке пробирки осторожно (подслаивая) приливают 10 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости при наличии триптофана наблюдается красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню.
Реакция Фоля
Принцип метода.Добавление к раствору белка крепкой щелочи и уксуснокислого свинца при кипячении приводит к потемнению раствора. Реакция обусловлена присутствием в белке серосодержащих аминокислот (цистеина и метионина). Эти аминокислоты при нагревании в присутствии щелочи разрушаются, образуя сернистый натрий:
Уксуснокислый свинец реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:
(СH3COO)2 + NaOH Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Сернистый натрий при взаимодействии с плюмбитом образует черный осадок сернистого свинца:
Na2S + Pb(ONa)2 + 2 H2O PbS + 4NaOH
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью –
5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия и по 1 капле 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Содержимое пробирок подвергают кипячению.
Материалы и реактивы: разбавленный раствор яичного альбумина (см. приложение Б, п.1); 1% раствор желатина; раствор растительного альбумина(cм. приложение Б, п.2.); 10%, 30% растворы гидроксид натрия; 1% раствор сульфата меди; 0,5% раствор нингидрина; азотная кислота концентрированная; уксусная кислота, ледяная; глиоксиловая кислота (см. приложение Б, п.3); серная кислота (d=1,84); 5% раствор уксуснокислого свинца.
Оборудование: пробирки; капельницы; спиртовки; водяная баня.
Контрольные вопросы
1. Назовите универсальные реакции на белки.
2. Укажите специфические реакции на аминокислоты.
3. Какие аминокислоты называются незаменимыми? Каково их строение?
4. Что такое аминокислотный скор?
5. По каким принципам классифицируются аминокислоты?
Таблица 1 - Основные параметры опыта и его результаты
| № пробирки | Состав буферной смеси, мл | рН смеси | 0,5% раствор желатина, мл | Этиловый спирт, мл | Степень мутности | |
| 0,1 н СН3СООН | 0,1 н СН3СООН | |||||
| 1,8 | 0,2 | 3,8 | 1,0 | 4,0 | ||
| 1,4 | 0,6 | 4,4 | 1,0 | 4,0 | ||
| 1,0 | 1,0 | 4,7 | 1,0 | 4,0 | ||
| 0,6 | 1,4 | 5,1 | 1,0 | 4,0 | ||
| 0,2 | 1,8 | 5,7 | 1,0 | 4,0 |
Материалы и реактивы:0,5%-ный раствор желатина; 0,1н раствор уксусной кислоты; 0,1н. раствор уксуснокислого натрия; 96%-ный этиловый спирт.
Оборудование: пробирки обыкновенные; мерные пипетки на 2 мл; цилиндры на 25 мл.
Таблица 2 - Результаты наблюдений
| Исследуемый материал | Денатурирующий фактор и его воздействие | Наблюдения |
Материалы и реактивы: раствор яичного альбумина 1% (см. приложение Б, п.4); 10%-ный раствор уксусной кислоты; 10%-ный раствор NаОН; 96%-ный этиловый спирт; 80%-ный ацетон; концентрированные кислоты Н2SO4, НСl, НNО3; 1%-ный раствор сульфата меди; 10%-ный раствор ТХУ; насыщенный раствор NаСI.
Оборудование: пробирки обыкновенные; пипетки на 1–2 мл; спиртовка.
Контрольные вопросы
1.Что такое денатурация белка?
2. Какие Вы знаете денатурирующие факторы и каков механизм их действия?
3. Какие структуры белковых молекул изменяются при денатурации?
4. Является ли денатурация обратимым процессом?
Нуклеопротеиды
По своему составу белки разделяют на два класса: простые (протеины) и сложные (протеиды). Простые белки при гидролизе дают только аминокислоты. Сложные белки при гидролизе дают не только аминокислоты, но также образуют и другие соединения. Часть белков, не состоящую из аминокислот, называют простетической группой. В зависимости от химической природы простетических групп белки классифицируют на нуклеопротеиды, фосфолипиды, липопротеиды, хромопротеиды и металлопротеиды.
В нуклеопротеидах простые белки гистоны или протамины связаны с нуклеиновыми кислотами РНК и ДНК. Эти белки содержатся в клеточных ядрах, рибосомах, митохондриях, микросомах, составляют основную массу вирусов. Нуклеопротеиды получают из тканей, богатых ядерным веществом (зобная железа, семенники, зародыши, дрожжи, печень, почки). Особая роль нуклеопртеидов среди сложных белков обусловлена входящими в их состав нуклеиновыми кислотами, с помощью которых происходит биосинтез белка, деление клеток, передача наследственной информации.
Нуклеиновые кислоты - это высокомолекулярные соединения, состоящие из остатков мононуклеотидов. При гидролизе мононуклеотиды образуют пуриновые и пиримидиновые основания, углевод (рибозу или дизоксирибозу) и фосфорную кислоту.
Нуклеиновые кислоты делятся на два вида: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК). Молекулы РНК содержат рибозу, молекулы ДНК - дезоксирибозу. В состав РНК входят аденин, гуанин, цитозин и урацил; в молекулах ДНК содержатся те же азотистые основания, но место урацила занимает тимин.
Различают первичную, вторичную и третичную структуры нуклеиновых кислот. Первичная структура - это порядок чередования нуклеиновых остатков в полинуклеотидных цепях. Вторичной структурой нуклеиновых кислот называют их спирализацию. В молекулах РНК заспирализованы отдельные участки цепи. Вторичная структура молекулы ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух полинуклеотидных цепей, спирализованных друг около друга. Вторичная структура обуславливается водородными связями, которые образуются между комплементарными азотистыми основаниями.
Третичная структура - это расположение спирализованных цепей в пространстве (клубки, двойные спирали и т. д.).
В состав фосфопротеидов входят остатки фосфорной кислоты, соединенные эфирной связью с оксиаминокислотами (серин, треонин), входящими в состав полипептидных цепей. Важнейшими представителями фосфопротеидов являются казеины молока животных, витегдины яиц, ихтулины рыб.
В липопротеидах роль простетической группы выполняют жироподобные вещества: нейтральные липиды, холестерин, лецитин и т.д. Наиболее изученными представителями этой группы являются a-липопротеиды и b- липопротеиды плазмы крови, тромбопластин, участвующий в свертывании крови, липопротеиды оболочек клеток, обуславливающие их проницаемость.
Глипопротеиды содержат в качестве простетической группы углеводные соединения: галактозу, маннозу, гексозамины, глюкуроновую кислоту и нукополисахариды.
Глипопротеиды содержатся в хрящах соединительной ткани, стекловидном теле, печени, почках крови, в слизистых выделениях животных.
Представителем хромопротеидов является гемоглобин крови, в котором белок связан с простетической группой-гемом. Гем является сложным азотистым соединением, содержащим железопротопорфирин. Гемы входят в состав цитохромов, которые участвуют в переносе электронов в процессе дыхания клеток.
К металлопротеидам относятся белки, содержащие различные элементы. К этой группе можно отнести гемоглобин, цинксодержащие белки половых желез, железистые белки печени, селезенки, медносодержащие альбумины печени, бромсодержащие белки нервной ткани.
Приложение А
(справочное)
Значение рКa для ионизируемых групп в аминокислотах
Таблица А. 1 - Значение рКa для ионизируемых групп в аминокислотах
| Аминокислота | ¾СООН | ¾NН3+ | Боковая группа | рКa в аминокислоте | Ожидаемое значение рКa в белке |
| Аланин | 2,3 | 9,9 | - | - | - |
| Аргинин | 1,8 | 9,0 |  | 12,5 | 12,0 |
| Аспарагин | 2,0 | 8,8 | - | - | - |
| Аспарагиновая кислота | 2,0 | 10,0 |  | 3,9 | 4,4-4,6 |
| Валин | 2,3 | 9,6 | - | - | - |
| Глутаминовая кислота | 2,2 | 9,7 | | 4,3 | 4,4-4,6 |
| Глутамин | 2,2 | 9,1 | - | - | - |
| Глицин | 2,4 | 9,8 | - | - | - |
| Гистидин | 1,8 | 9,2 |  | 6,0 | 6,5 – 7,0 |
| Изолейцин | 2,4 | 9,7 | - | - | |
| Лейцин | 2,4 | 9,6 | - | - | - |
| Лизин | 2,2 | 9,2 | ¾NН3+ | 10,8 | 10,0 – 10,2 |
| Метионин | 2,3 | 9,2 | - | - | - |
| Фенилаланин | 1,8 | 9,1 | - | - | - |
| Пролин | 2,0 | 10,6 | - | - | - |
| Оксипролин | 1,92 | 9,73 | - | - | - |
| Серин | 2,1 | 9,2 | - | - | - |
| Треонин | 2,6 | 10,4 | - | - | - |
| Триптофан | 2,4 | 9,4 | - | - | - |
| Тирозин | 2,2 | 9,1 |  | 10,9 | 9,6 – 10,0 |
| Цистеин | 1,8 | 10,8 | -SН | 8,3 | 8,5 – 8,8 |
Приложение Б
(справочное)
Белки
Методические указания к лабораторному практикуму
по дисциплине ”Биохимия» для студентов специальностей
49 01 01 “Технология хранения и переработки растительного сырья”
49 01 02 “Технология хранения и переработки животного сырья”
91 0101 “Производство продуктов и организация общественного
питания”
Могилев 2003
УДК 557.1
Рассмотрены и утверждены
на заседании кафедры ХТВМС
Протокол № 10 от 20 мая 2003 г.
Составители: доц. О.Н.Макасеева
ст. препод. О.В.Дудинская
асс. Л.М.Ткаченко
Рецензент доц., к.т.н. Т.М.Тананайко
Редактор Т.Л. Бажанова
Технический редактор А.А.Щербакова
¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
Подписано в печать_____________ Формат 60х84 1/16
Печать офсетная. Усл. печ. л _________ Уч.-изд. л _________
Тираж _____ экз._______Заказ ______ Бесплатно
Лицензия № 226 от 12.02.2003г.
¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
Отпечатано на ризографе МГУП
212027, г. Могилев, пр. Шмидта, 3
Ó Могилевский государственный университет продовольствия
Содержание
1 Общие указания к методике выполнения и защиты лабораторных работ. 4
2 Цветные реакции на белки. 4
2.1 Биуретовая реакция. 5
2.2 Нингидриновая реакция. 6
2.3 Ксантопротеиновая реакция. 7
2.4 Реакция Адамкевича. 8
2.5 Реакция Фоля. 9
3 Физико-химические свойства белков. 10
3.1 Определение изоэлектрической точки белков. 10
3.2 Высаливание белков сульфатом аммония. 11
3.3 Необратимое осаждение белков. 12
3.3.1 Осаждение белков органическими веществами. 12
3.3.2 Денатурация белков при нагревании. 13
3.3.3 Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами. 14
3.3.4 Осаждение белков органическими кислотами. 14
3.3.5 Осаждение белков солями тяжелых металлов. 14
3.4 Разделение и очистка белков методом диализа. 15
4 Методы определения азота в биологических объектах. 17
4.1 Количественное определение общего азота по методу Къельдаля. 17
4.2 Определение различных форм азота в молоке и сыре. 21
4.2.1 Метод определения общего количества азота в сыре. 23
4.2.2 Метод определения общего количества растворимого азота. 24
4.2.3 Метод определения азотосодержащих небелковых соединений. 25
4.2.4 Метод определения аминного азота (пептиды, аминокислоты, амиды, аммиак) 25
4.3 Определение белка в молоке по Лоури. 26
5 Определение влажности весовым методом. 28
5.1 Метод высушивания до постоянной массы.. 28
5.2 Определение влажности ускоренным методом высушивания. 29
5.3 Определение влажности экспрессным методом высушивания. 29
6 Нуклеопротеиды.. 30
6.1 Гидролиз нуклепротеидов дрожжей. 31
Список используемых источников. 33
1 Общие указания к методике выполнения
и защиты лабораторных работ
Перед выполнением лабораторных работ студенты должны самостоятельно изучить теоретический материал соответствующих тем курса, используя рекомендуемую литературу, оформить первых два раздела отчета – «Теория» и «Методика». В разделе «Теория» приводятся основные положения, формулировка теорий и гипотез, уравнения химических реакций с написанием структурных формул, в разделе «Методика» – принципы и изложение метода.
К работе допускаются студенты, выполнившие эти требования и ознакомленные с оборудованием и приборами, знающие свойства используемых химических реагентов и образуемых продуктов реакции в ходе эксперимента.
Во время выполнения работы проводятся соответствующие наблюдения над объектами исследования. В лабораторном журнале отмечаются физические и физико-химические эффекты, сопровождающие химические взаимодействия, делаются расчеты, составляются таблицы и рисунки, формулируется результат, что определяет содержание третьего раздела отчета «Наблюдение и результаты». В последнем разделе студенты делают выводы на основании полученного результата и знания теории.
Записи выполняются четко и аккуратно, без сокращений, за исключением принятых, оставляются поля. До ухода с занятий отчет представляют на подпись преподавателю. Защита проводится в соответствии с графиком выполнения и защиты лабораторных работ.
Цветные реакции на белки
Присутствие белка в биологических объектах или растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, которые обусловлены наличием аминокислот в белке, их специфическими группами или пептидными группами.
Существуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки (биуретовая и нингидриновая). Кроме того, имеются специфические реакции, которые обусловлены наличием определенных аминокислот в молекуле белка. На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических анализах.
В данной работе студент должен не только провести универсальные и специфические реакции на белки, но и сделать вывод о питательной ценности исследованных белков, которая определяется содержанием незаменимых аминокислот.
Незаменимых (обязательных) аминокислот для человека восемь: валин (Вал), лейцин (Лей), изолейцин (Иле), треонин (Тре) , метионин (Мет), лизин (Лиз) , фенилаланин (Фен),триптофан (Трп). Две аминокислоты являются частично незаменимыми – это аргинин и гистидин. Они не синтезируются в организме детей. Эти аминокислоты, как и все другие, синтезируют микроорганизмы и зеленые растения, но не могут синтезироваться в организме животного и человека, т.к. нет аналогов соответствующих кетокислот, необходимых для их биосинтеза. Незаменимые аминокислоты должны быть обязательно введены в организм человека или животного с пищей. Если их будет в пище недостаточно, то нормальное развитие и жизнедеятельность организма нарушаются, т.к. не могут синтезироваться белки, содержащие их.
Отдельные пищевые белки могут быть биологически неполноценными по своему аминокислотному составу. Однако необходимо исследовать аминокислотный состав не отдельных белков, а всего их комплекса, содержащегося в пищевом продукте. Только при таком подходе могут быть получены правильные данные об аминокислотном составе, а следовательно, и о пищевой ценности продукта. Для питания большое значение имеет сбалансированность аминокислотного состава белков.
По содержанию в белке незаменимых аминокислот, определяемых химическими методами, вычисляют аминокислотный скор, которым характеризуют биологическую ценность белка. В продукте определяют содержание каждой незаменимой аминокислоты. Найденное количество вычисляют в процентах к содержанию той же аминокислоты в идеальном белке (куриного яйца, молока). Чаще всего в качестве идеального белка применяют аминокислотную шкалу Комитета ФАО/ВОЗ (ФАО-Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН – межправительственная организация, специализированное учреждение ООН. ВОЗ- Всемирная организация здравоохранения).
Аминокислотный скор каждой незаменимой аминокислоты в идеальном белке (шкале ФАО/ВОЗ) принимают за 100%.
Расчет аминокислотного скора ведут по формуле
B
АK = ¾¾¾¾ × 100, (1)
C
где АK – аминокислота;
В - содержание (мг) незаменимой аминокислоты в 1 г исследуемого белка;
С – содержание (мг) этой же незаменимой кислоты в 1 г идеального белка (шкале ФАО/ВОЗ).
По вычисленному скору определяют лимитирующую биологическую ценность изучаемого белка. Аминокислота с наименьшим скором является дефицитной в данном белке. Для растительного белка чаще всего дефицитным является лизин, триптофан, метионин и треонин. Белки животного происхождения – мяса, молока, яиц – биологически более ценные, т.к. их аминокислотный состав ближе к аминокислотному составу органов и тканей.
Биуретовая реакция
Принцип метода. В щелочной среде в присутствии солей меди растворы белка приобретают фиолетовый цвет с красным или синим оттенком, зависящим от количества пептидных связей в молекуле. Продукты неполного гидролиза белка, содержащие не менее двух пептидных связей, дают биуретовую реакцию с красным оттенком. Реакция обусловлена наличием пептидных групп, которые в щелочной среде образуют с ионами двухвалентной меди окрашенные комплексы.
В щелочной среде пептидная группа присутствует в своей таутомерной енольной форме:
Ион меди взаимодействует с отрицательным зарядом диссоциированной в этих условиях ОН-группой – возникает солеобразная связь; кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Комплексное соединение меди с енолизованными пептидными группами при участии четырех атомов азота можно представить следующим образом:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 10%-ного раствора NаОН и по одной капле 1%-ного раствора сульфата меди. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Развивается фиолетовое окрашивание с соответствующим оттенком.
Нингидриновая реакция
Принцип метода. Белки, полипептиды, как и свободные a-аминокислоты, дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином (гидрат трикетогидриндена). Реакция характерна для a-аминогрупп аминокислот.
На I стадии реакции образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования (образование NН3) и декарбоксилирования (образование СО2) a-аминокислот:
Окисленный Восстановленный
нингидрин нингидрин
На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570нм) пропорциональна количеству аминокислоты:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 0,5%-ного раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 минуты в пробирках появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.
Ксантопротеиновая реакция
Принцип метода.При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты белок выпадает в осадок, который при нагревании растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет. Эта реакция характерна для ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофона), которые подвергаются нитрованию:
Нитропроизводное аминокислот в щелочной среде образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет. Например:
Ход работы.В одну пробирку наливают 5 капель разбавленного раствора яичного альбумина, во вторую – 5 капель 1%-ного раствора желатина, в третью – 5 капель 1%-ного раствора растительного альбумина. Затем в пробирки добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и нагревают (осторожно!). При нагревании раствор и выпавший белый осадок или муть от свернувшегося белка окрашиваются в ярко-желтый цвет при наличии ароматических аминокислот: в пробирке с желатином появляется едва заметное бледно-желтое окрашивание (обусловленное незначительной примесью других белков). Пробирки охлаждают, после этого в них осторожно добавляют по 10 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия. Выпавший в начале осадок белка растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.
Реакция Адамкевича
Принцип метода. При добавлении к раствору белка небольших количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание. Эта реакция характерна для триптофана, который в кислой среде вступает в реакцию с альдегидами с образованием окрашенных продуктов конденсации. Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, которая всегда содержит следы глиоксиловой кислоты:
Ход работы. В одну пробирку нали