Оценка качества окрашенного цитологического препарата

Световая микроскопия

Микроскопирование — основной метод изучения клеток. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью и позволяющие изучать очень тонкие детали строения клеток. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d0). В основном оно зависит от длины световой волны λ, и эта зависимость приближенно выражается формулой d0 = λ / 2. Таким образом, чем меньше длина световой волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам структуры можно видеть в препарате (т.е. выше «разрешение» микроскопа). Понятие «увеличение микроскопа» относится к его оптической системе и выражается в произведении увеличений объектива и окуляра. Однако «разрешение» микроскопа зависит от характеристик объектива и не зависит от окуляра.

Для изучения цитологических препаратов чаще применяют обычные световые микроскопы различных марок, когда в качестве источника освещения используют естественный или искусственный свет. Минимальная длина волны видимой части спектра света соответствует примерно 0,4 мкм (фиолетовый спектр). Следовательно, для обычного светового микроскопа разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) достигает 2000 раз.

Устройство светового микроскопа:

В микроскоп входят 3 системы: -оптическая,

- осветительная,

- механическая.

1.Оптическая система включает объектив и окуляр.

а) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).

Обычные увеличения объектива:

х8, х20, х40 (сухие объективы), х90 (иммерсионный объектив).

При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.

б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением:
х7, х10, х15.

в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например: (х20)• (х10) = 200 раз.

г) Таким образом, функция оптической системы -формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.

2.Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.

а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа).

б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.

Одна поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая; последняя используется при искусственном освещении.

в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.

г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить - для ослабления сферической аберрации.

3. Механическая система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик (10).

а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты.

Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.

В итоге, световые лучи проходят следующий путь:

источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3).

Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.

Для получения правильной информации необходимо последовательное микроскопическое изучение всего цитологического мазка. Обзор цитологической картины проводят под малым увеличением (х10), детализацию выбранных объектов – под увеличением (х20, х40); далее микроскопическое изучение мазка выполняется под иммерсионным объективом (х90, х100). Вначале проводят систематическое изучение полей зрения по краю мазка. Затем мазок исследуют методом «систематического перекрестного двухразового шага», который позволяет практически без пропуска изучить каждый миллиметр площади препарата.

Подсобными методами является фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия с использованием флюорохрома, которая применяется преимущественно при массовых профилактических осмотрах женщин. Люминесцентный метод позволяет видеть клетки и различать их по цвету свечения, возникшего под влиянием флюорохрома, фазово-контрастный – рассмотреть особенность клеток, не прибегая к фиксации и окраске (в нативном состоянии) даже с иммерсионной системой. Оба метода не требуют много времени на подготовку препарата, однако и не сокращают срока его исследования и не всегда дают возможность уточнить диагноз. Метод нативного препарата при световом микроскопе в цитологическом исследовании играет ориентировочную роль и используется в общем клинико-лабораторном анализе.

Оценка качества окрашенного цитологического препарата.

Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии.

Хороший качественно окрашенный мазок должен:

- равномерно окрашиваться;

- не содержать артефакты (рыхлые скопления краски) и сморщенные клетки;

- иметьв достаточном количестве равномерно распределенные клетки (все участки мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток);

-окрашивать элективноструктуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек.

В основе окрашивания клеток лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах.

При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания.

Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что обеспечивается использованием буферных растворов.

Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю–Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин – эозиновый, метод Папаниколау.

Самым распространённом методом окраски является окраска гематоксилин-эозином. Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры (ядра приобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма – желтовато-розовыйцвет). Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению (по методу Эрлиха, Майеру, Караци –калийными квасцами), в результате чего он превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель). При этом на окисление гематоксилина требуется от 10 дней до 2 - 3 недель. Этот процесс ускоряют с помощью солей алюминия, хрома, железа и др.

• Квасцовый гематоксилин Майера приготовляют следующим образом: в литре дистиллированной воды растворяют 1 г гематоксилина, 0,2 г йодновато-кислого натрия (KaJ03) и 50 г калийных квасцов. Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты. Раствор годен для немедленного употребления и долгое время хорошо сохраняется. Препарат красят в течение 5 – 10 минут, после чего 10 минут промывают в проточной воде.

• Квасцовый гематоксилин по Эрлиху. Для приготовления красителя 2 г гематоксилина растворяют в 100 см³ 96-градусного спирта и добавляют 100 см³ воды, 100 см³ химически чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 см³ уксусной кислоты.

Краситель должен «созревать» примерно 14 дней. Раствор сохраняет свою красящую силу долгое время. Если вместо гематоксилина взять 0,25 – 0,5 ггемагина, то краситель пригоден к употреблению тотчас же после изготовления. Окрашивание производят так же, как и гематоксилином Майера. Ядра окрашиваются в темно-синий цвет.

• Квасцовый гематоксилин по Караци. Гематоксилина – 0,5 г, калийных квасцов – 25г, нодноватокислого калия КГО₃ – 0,01 г, глицерина – 100 см3, дистиллированной воды – 400 см3.

Преимуществом гематоксилиз-эозиновых красителей является выраженное окрашивание ядер с атипией, в связи с чем этот метод хорошо использовать для исследования мазков при скрининге.

Окраска азур – эозиновыми красителями.

Метод окрашивания по Романовскому (азур-эозиновой смесью) в разных лабораториях используется в разных модификациях – по Паппенгейму (Май-Грюнвельду-Гимзе), Лейшману, Романовскому-Гимзе и т.д. Преимущество метода является четкое прокрашивание ядер, вследствие чего хорошо просматриваются структуры хроматина, а также бактериальная флора и простейшие.

Окраска по Романовскому-Гимзе.Краситель состоит из щелочной части (азур II - ярко-синий цвет), и кислой части (эозин - розово-красный цвет).

В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 млдистиллированной воды.

Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя).Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра –в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый.Результаты окрашивания мазков крови:

· Ядра клеток – красно-фиолетовые.

· Эозинофильные гранулы – красновато-коричневые.

· Базофильные гранулы – синие.

· Нейтрофильные гранулы – фиолетовые.

· Цитоплазма лимфоцитов – голубая.

· Эритроциты – бледно-красные.

· Тромбоциты – наружная часть синяя (более светлая); внутренняя – фиолетовая (более темная).

Окраска по Маю-Грюнвальду.Данный метод очень удобен для визуализации гранулоцитов.Для окрашивания применяется готовый раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5 минут промывают и высушивают.

· Лимфоциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая.

· Моноциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая.

· Гранулоциты – ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темно-синие (зависит от типа).

· Тромбоциты– наружная часть голубая; внутренняя – фиолетовая.

· Эритроциты– розовые.

Окраска по Паппенгейму. Представляет собой комбинацию двух предыдущих методов.Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3 – 5минут. После этого контейнер с мазками ополаскивается дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20 – 30минут. После этого мазки промываются проточной водой и высушиваются.

· Ядра клеток – красно-фиолетовые.

· Цитоплазма лимфоидных клеток – светло-синяя.

· Лимфоидная азурная грануляция – ярко-синяя.

· Миелоидная азурная грануляция – фиолетовая.

· Нейтрофильные гранулы – светло-фиолетовые.

· Эозинофильные гранулы – красные, красно-коричневые.

· Базофильные гранулы – темно-фиолетовые, черные.

· Эритроциты – розовые (полихроматофильные эритроциты - синеватые).

· ТельцаЖолли – красновато-фиолетовые.

· Тельца Ауэра – ярко-красные.

Методика окраски по Лейшману.Высушенные на воздухе препараты заливают краской Лейшмана на 3 мин., при этом препарат одновременно фиксируется. После этого промывают водопроводной водой и заливают азур - эозиновой смесью (40 мл 0, 1% азура II и 30 мл 0,1% эозина К) на 15 – 20 мин. Затем промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. используется для выявления малярийных плазмодиев.