Альтернативные формы ДНК

Рассмотренная модель ДНК соответствует В-форме, которая характеризуется плоскопараллельным расположением пар нуклеотидных оснований внутри двойной спирали. Плоскости почти перпендикулярны оси спирали и отстоят друг от друга на 3,4 А, на один виток спирали приходится 10 пар оснований. B-форма характерна для волокон ДНК при очень высокой влажности (92 %) и в растворах солей низкой ионной силы. Считают, что именно в такой форме ДНК обычно находится в живой клетке.

Известны другие типы ДНК – отличающиеся от В-формы числом нуклеотидов на виток и расстоянием между нуклеотидами, шагом спирали и углом наклона между плоскостью оснований и осью спирали. Конфигурация зависит от содержания солей в препарате, нуклеотидного состава ДНК и относительной влажности препарата. Монокристаллический рентгеновский анализ увеличил разрешение от 5 до 1, позволил рассмотреть каждый атом в молекуле и получить более точную и подробную структуру.

А-форма обнаружена в волокнах ДНК при 75% влажности и концентрированных растворах с высокой ионной силой, нуждается в присутствии ионов натрия, калия и цезия, несущих противоположный заряд или в сухой ДНК. Основания наклонены по отношению к оси спирали – угол наклона 20 , число оснований на виток больше, чем в В-форме – 11, диаметр 23. А-форма близка к структуре гибридов ДНК-РНК и двуспиральных участков РНК, этим она интересна с биологической точки зрения.

С-форма образуется, когда ДНК находится при влажности 66%, в присутствии ионов лития. Число пар оснований на виток меньше, чем в В-форме – 9 1/3.

В формах А-, В- и С- могут находиться все ДНК, независимо от их нуклеотидной последовательности.

D-форма и Е-форма (возможно, крайние варианты одной и той же формы) имеют наименьшее число пар оснований на виток (8 и 7,5) и обнаружены только в определенных молекулах ДНК, не содержащих гуанина. Недавно описана Р-ДНК.

Z-форма представляет собой наиболее резкий контраст с выше рассмотренными формами (открыта в 1979 г. Эндрю Ванг и Александром Рич). Эта форма левосторонняя, тогда как все остальные – правосторонние. Числа пар оснований на виток – 12, то есть она менее скрученная и более тонкая (d = 18). Сахарофосфатный остов образует вдоль спирали зигзагообразную линию. Найдена Z-форма двойной спирали в полимерах, имеющих многократно повторяющиеся динуклеотидные пары:

polu-d (GC ) n и polu-d ( AC)n – 26-32 дуплета.

CG TG

Z-форма существует только при очень высоких концентрациях соли, что объясняется необходимостью противостоять повышенному электростатическому отталкиванию между нуклеотидами, сжатыми из-за уменьшения диаметра двойной спирали Z-формы.

Белки оказывают значительное влияние на возможность перехода из В-формы в Z-форму. Например, ДНК, связанная с гистонами, не переходит из одной формы в другую в тех условиях, когда это наблюдают у свободной ДНК. Одним из условий, необходимых для образования Z-ДНК in vivo, по-видимому, является присутствие особых белков, стабилизирующих ее структуру. Присутствие Z-ДНК in vivo пока не доказано.

Водородные связи и анализ структуры нуклеиновых кислот.

Природа водородных связей уникальна. При слабом нагревании двойная спираль денатурирует и раскручивается. При медленном охлаждении смеси комплементарных одноцепочечных молекул ДНК они реассоциируют, вновь образуя двойную спираль. У молекул с более высоким содержанием пар Г-Ц (три водородных связи) по сравнению с А-Т температура плавления выше.

Методы молекулярной гибридизации

В основе методов молекулярной гибридизации лежит способность нуклеиновых кислот к обратимой денатурации. При соответствующей температуре между ДНК разных видов, между ДНК и РНК образуются гибридные молекулы, что говорит о сходстве их последовательностей.

Репликация ДНК

ДНК может быть представлена линейной формой. Длина молекул ДНК, выделенных из клеток из дрозофилы, составляет 1,2 см. У мелких вирусов, хлоропластов и митохондрий геном представляет собой кольцевую ДНК, в которой обе цепи двойной спирали замкнуты в непрерывное кольцо. У E. coli длина кольца около 1 мм. В бактериальном и эукариотическом геномах ДНК может находиться в виде больших петель.

Репликация важнейшая функция генетического материала, которая необходима для поддержания генетической непрерывности клеток. Репликация – это создание себе подобной структуры, что позволяет точно воспроизводить генетическую информацию, хотя возможны и ошибки. Во второй статье в Nature Уотсон и Крик предложили полуконсервативную модель репликации ДНК, которая была впоследствии подтверждена на вирусах, прокариотах и эукариотах.

Репликация линейных молекул начинается в определенных точках с образованием репликационных вздутий. В небольших молекулах ДНК вирусов репликация может начинаться с одной точки, в больших молекулах ДНК, образующих хромосомы эукариот, иногда насчитываются сотни точек инициации репликации. Соседние вздутия могут сливаться, а когда вздутие достигает конца молекулы, образуется характерная Y-образная конфигурация.

Точка, в которой происходит репликация, получила название репликационной вилки (иногда называемой точкой роста). Репликационная вилка – это область между нерасплетенной родительской двухцепочечной ДНК и вновь синтезированными дочерними двойными цепями ДНК. Репликация может осуществляться либо в одном, либо в двух направлениях. При однонаправленной репликации движется одна репликационная вилка вдоль ДНК. При двунаправленной репликации от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликационные вилки.

После расплетания и разделения родительские цепи двойной спирали ДНК выступают в роли матриц, по которым синтезируются растущие комплементарные дочерние цепи.

Синтез ДНК как у про-, так и у эукариот осуществляется при участии множества разных ферментов. Основную роль играет ДНК-полимераза, которая последовательно присоединяет новые звенья к растущей полинуклеотидной цепи в соответствии с принципом комплементарности и катализирует образование фосфодиэфирных связей. Для действия ДНК-полимеразы необходимо наличие 3-ОН-затравки, без 3-ОН-затравки фермент не способен направлять синтез цепи.

Нуклеиновые кислоты синтезируются только от 5 к 3 концу. Так как цепи двойной спирали ДНК антипараллельны, то есть в области репликационной вилки присутствуют и 3- и 5- концы синтезируемых цепей, то синтез одной цепи идет непрерывно (ведущая цепь), а другой прерывисто (отстающая цепь). Для синтеза отстающей цепи необходимо образование новых затравочных участков. Синтез ведущей и отстающей цепей происходит по мере продвижения репликационной вилки вдоль двойной спирали родительской ДНК. Процесс расплетания и экспонирования двух матричных цепей ДНК происходит при участии белков трех типов и сопровождается значительными энергетическими затратами. Белок первого типагеликаза осущетвляет собственно расплетание спирали, а необходимая энергия поставляется за счет гидролиза АТР.

Белок второго типа SSB специфически связывается с одноцепочечной ДНК, предотвращая преждевременную реассоциацию цепей.

Расплетание двойной спирали без вращения приводит к образованию дополнительных витков или узлов на участках ДНК вблизи репликационной вилки. Белок третьего типа топоизомераза, способствует релаксации сверхскрученных участков ДНК, внося одноцепочечные разрывы фосфодиэфирных связей и раскручивая узлы в области родительской двойной спирали перед репликационной вилкой. После такого раскручивания и снятия напряжения, связанного с образованием дополнительных витков спирали, топоизомераза вновь замыкает разорванные фосфодиэфирные связи и восстанавливает структурную целостность родительской ДНК.

ДНК синтезируется довольно быстро, колеблется от 500 нуклеотидов в 1 сек у бактерий, до 50 нуклеотидов в 1 сек у млекопитающих.