Д. Гибридизация нуклеиновых кислот

Вторичная структура нуклеиновых кислот образуется за счёт слабых взаимодействий - водородных и гидрофобных. Поэтому если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С, то связи, удерживающие две цепи двойной спирали вместе, разрушаются. В результате разрыва водородных и гидрофобных связей цепи ДНК расходятся. Этот процесс называют "денатурация".Однако если раствор, содержащий денатурированную ДНК, очень медленно охлаждать, то могут получиться двухспиральные структуры, идентичные исходным. Такой процесс получил название "ренативация".

На явлении денатурации и ренативации основан метод, называемый "молекулярная гибридизация".Процесс гибридизации может осуществляться между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК, ДНК-РНК) при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Такие гибридные структуры можно выделить центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или наблюдать в электронном микроскопе (рис. 4-13).

Если раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2, выделенные из организмов разных видов, денатурировать, а затем провести ренатива-цию, то образуются двухспиральные структуры. Но наряду с исходными ДНК 1 и ДНК 2

Рис. 4-12. Строение эукариотических и прокариотических рибосом. Величина S характеризует скорость оседания частиц при ультрацентрифугировании и пропорциональна их молекулярной массе. Рибосома прокариотов (70S) состоит из 50S и 30S субъединиц, эукариотов (80S) - состоит из субъединиц 60S и 40S. Рибосомы эукариотов и прокариотов различаются по молекулярной массе субъединиц, количеству молекул рРНК, массе рРНК, количеству и разнообразию белков, способных связывать специфические лиганды.

образуются гибридные двойные спирали, содержащие цепь ДНК образца 1 и цепь ДНК образца 2, где присутствуют как спирализо-ванные, так и неспирализованные участки. В неспирализованных участках фрагменты цепей ДНК не комплементарны, т.е. в ходе гибридизации получаются несовершенные гибриды. Методом молекулярной гибридизации можно установить:

· сходство и различие первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот;

· различие ДНК, выделенных из организмов разных видов;

· идентичность ДНК всех органов и тканей одного организма.

При проведении гибридизации ДНК-РНК были выделены гибридные молекулы, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для эксперимента были взяты ДНК и РНК (первичный транскрипт), выделенные из одного организма, то образовывались совершенные гибриды, потому что молекула РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией ДНК-РНК было впервые установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки.

Рис. 4-13. Гибридизация нуклеиновых кислот. А - гибридизация ДНК-ДНК; Б - гибридизация ДНК-РНК.

II. РЕПЛИКАЦИЯ

Живые организмы в течение S-фазы клеточного цикла, которая предшествует делению клетки, удваивают содержание ДНК таким образом, что каждая дочерняя клетка после деления получает набор хромосом, идентичный родительской клетке. Процесс удвоения хромосом называют репликацией (редупликацией).

Хромосома содержит одну непрерывную двухцепочечную молекулу ДНК. При репликации каждая цепь родительской двухцепочеч-ной ДНК служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Вновь образованная двойная спираль имеет одну исходную (родительскую) и одну вновь синтезированную (дочернюю) цепь. Такой механизм удвоения ДНК получил название "полуконсервативная репликация"(рис. 4-14). Первичная структура дочерней цепи определяется первичной структурой родительской цепи, потому что в основе её образования лежит принцип комплементарно-сти оснований (G ≡ С и А = Т).

Ферменты и белки, участвующие в репликации, должны работать быстро и точно. Эти условия выполняются с помощью особого мультиферментного комплекса.

Репликацию можно разделить на 4 этапа: образование репликативной вилки (инициация), синтез новых цепей (элонгация), исключение праймеров, завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК (терминация).