Прямые доказательства генетической роли ДНК
Лекция
Молекулярные основы наследственности
Классическая генетика
В основе открытий Г. Менделя о закономерностях наследования признаков (1865) лежит представление о дискретности – генетический материал состоит из дискретных единиц наследственности – генов. Вторичное открытие законов Менделя (1900) привело к бурному развитию менделевской генетики.
В начале XX в. Т. Морганом и его сотрудниками была доказана физическая связь между геном и хромосомой.
Несмотря на бурное развитие генетики основная концепция генетики – концепция гена – оставалась лишенной материального содержания. Что представляет собой образующее ген вещество, способное к саморепликации, мутациям и фенотипическому проявлению? В 1950 г. Г. Меллер писал: «…. истинная сущность генетической теории все еще покоится в глубинах неизвестного».
К началу 40-ых годов в результате принципиально новых подходов (физических и химических методов) создались реальные условия для раскрытия материальной основы гена, ранее абстрактного и неделимого. Многие физики обратились к решению биологических проблем, среди которых – какая физическая основа генетической информации.
Нильс Бор выдвинул идею, что некоторые биологические явления, возможно, нельзя будет объяснить полностью, исходя лишь из традиционных физических понятий. В 1935 г. ученик Н. Бора Макс Дельбрук в статье «О природе генных мутаций и структуре гена» писал, что именно генетика является той областью, в которой объяснения с позиций физики и химии могут оказаться «недостаточными» в том смысле, который имел в виде Бор. Так, например, невозможно описать классической физикой квантового поведения.
Значительным толчком к изучению природы гена послужил обзор Э. Шредингера « Что такое жизнь с точки зрения физика» (1945).
Нуклеиновые кислоты – носители наследственной информации
История изучения нуклеиновых кислот начинается с открытия швейцарского биохимика Фридриха Мишера, который в 1869 г. выделил из клеток гноя вещество и назвал его «нуклеином». Дальнейшие исследования спермы лосося выявили, что «нуклеин» обладает кислотными свойствами и его стали называть нуклеиновой кислотой.
Существует два типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК). С помощью химического анализа и гистохимических методов окрашивания было установлено, что ДНК содержится в ядре клетки и, по-видимому, локализуется в хромосомах, тогда как РНК обнаруживается повсеместно – и в ядре, и в цитоплазме.
В клеточном ядре ДНК обнаруживается в виде нуклеопротеида. До 1944 г. о химическом составе и структуре хромосом и генов было известно крайне мало. Предполагалось, что генетическим материалом могут служить как нуклеиновые кислоты, так и хромосомные белки.
Генетические функции хромосом, такие как способность определять развитие признаков, способность к самоудвоению до начала 40-ых годов XX в. большинство ученых связывали с белками, так как белок может принимать множество уникальных конфигураций.
Косвенные доказательства генетической роли ДНК
1. ДНК присутствует во всех клетках – растительных, животных и бактериальных и содержится фактически только в ядрах этих клеток.
2. Все соматические клетки одного вида содержат строго постоянное количество ДНК независимо от их функциональной дифференцировки и метаболического состояния в противоположность РНК.
3. В гаплоидных зародышевых клетках количество ДНК составляет половину количества ДНК в диплоидных соматических клетках, то есть количество ДНК изменяется прямопропорционально плоидности соматических клеток.
4. Обнаружена прямая зависимость между поглощением УФ лучей определенной волны и количеством наследственных изменений у микроорганизмов. Максимальным мутагенным действием обладают УФ лучи той части спектра, (2537 А), в которой специфически поглощают нуклеиновые кислоты.
Прямые доказательства генетической роли ДНК
Исследования, поведенные период с 1944 по1953 гг., доказали, что генетическую основу жизненных процессов составляет молекула ДНК.
Ранние генетические исследования были сконцентрированы на высших организмах, но первые сведения о физических и химических основах наследственности были получены при работе с микроорганизмами. Бактерии, вирусы оказались удобными объектами для исследования наследственности и природы генетического материала.
Преимущества микроорганизмов как генетических объектов:
1. Они обычно гаплоидны, нет перекрытия рецессивных генов доминантными, что позволяет сразу проявляться мутантному гену.
2. При размножении создают точные копии самих себя.
3. Скорость размножения. В питательной среде за один день плотность популяции, возникшей из одной клетки Escherichia coli, может достигнуть 2-3 109 бактерий в миллилитре.
Наиболее интенсивно исследуемый вид бактерий Escherichia coli – кишечная палочка.
Уникальная роль нуклеиновых кислот в передаче наследственной информации была показана в опытах трех совершенно различных типов.
1. ДНК – трансформирующий фактор пневмококка (Diplococcus pneumoniae).
Явление трансформации впервые обнаружил английский бактериолог Фредерик Гриффит в 1928 г. при изучении пневмококковой инфекции у мышей. Имеются вирулентные и невирулентные штаммы этого микроорганизма. Вирулентные штаммы вызывают заболевание пневмонией и образуют на твердой питательной среде гладкие блестящие колонии, обзначаемые буквой S (от англ. smooth – гладкий). Вирулентность определяется капсульным полисахаридом, расположенным на поверхности клеточной стенки. Несколько разных «типов» пневмококков несут различные полисахариды: тип I, тип II, тип III.
Любой из этих типов может дать мутантов, неспособных к образованию капсульных полисахаридов (утрачивается ферментативная активность, необходимая для синтеза слизистых оболочек). Невирулентные штаммы на твердой питательной среде образуют шероховатые колонии, обозначаемые букой R (от англ. rough – шероховатый). При инфицировании они фагоцитируются в организме животного и не вызывают воспаление легких.
R бактерии размножаются также успешно, как и S бактерии. Мутация S R идет исключительно в одном направлении, обратные мутации R S восстанавливают способность синтеза полисахаридной капсулы, тип которой в ривертантах всегда совпадает с типом полисахарида исходного родительского типа: I S I R, II S II R, III S III R и т.д ( различные серотипы).
Опыты показали:
1. Инъекция бактериями R штамма – мыши выживали.
2. Инъекция бактериями S штамма, убитых нагреванием – мыши выживали. При t = 650C прекращается ферментативная активность бактериальной клетки, но сохраняется активность трансформирующего фактора.
3. Инъекция смеси клеток – штамма типа II R вместе с убитыми нагреванием клетками III S – мыши погибали от пневмококковой инфекции, вызванной вирулентными бактериями III S. Тот факт, что вирулентные бактерии синтезируют полисахаридную капсулу типа III, а не II, свидетельствовало о том, что эти клетки не могли возникнуть в результате обратной мутации в клетках II R (II R II S).
Вывод: какой-то компонент мертвых бактерий типа III S может трансформировать живых бактерий типа II R так, что они начинают синтезировать капсульный полисахарид типа III S.
Впоследствии трансформация невирулентных штаммов в вирулентные была обнаружена и в лабораторной культуре клеток. Метод in vitro (в пробирке) позволил исследовать природу трансформирующего фактора убитых нагреванием клеток III S непосредственно, не вводя их мышам и не дожидаясь гибели последних.
В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти показали, что трансформирующий фактор – это ДНК. Разделили разрушенные клетки капсульного штамма на различные химические компоненты и определили их трансформирующую активность. Добавление в растущую культуру клеток II R очищенной ДНК пнемококка III S оказалось достаточным для возникновения способности синтезировать капсульный полисахарид типа III S. Добавление фермента дезоксирибонуклеазы, расщепляющего ДНК, необратимо инактивирует трансформирующий фактор.
О. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти впервые показали, что наследственная способность клетки осуществлять определенную биосинтетическую функцию может передаваться другой клетке вместе с очищенной ДНК.
Механизм трансформации: фрагменты ДНК, в том числе содержащие ген, ответственный за синтез полисахарида, из убитых нагреванием клеток S попадают в R-клетки и посредством рекомбинации включаются в их ДНК.
Фундаментальное значение этого открытия не было оценено по следующим причинам:
1. Знания о химической структуре ДНК были неполными и неправильно интерпретировались. Считалось, что ДНК недостаточно сложноорганизованное химическое вещество для содержания огромного количества информации.
2. Многие ученые полагали, что химической основой генов служат белки, относительно которых было известно, что они устроены сложно, тогда как ДНК была оставлена роль структурного вещества.
3. Изучение наследственных основ бактерий в 1944 г. только начиналось, и не было установлено, что бактериальные гены во всех отношениях аналогичны генам высших организмов.
2. Нуклеиновые кислоты – наследственный материал вирусов
Бактериофаг Т2 – это вирус, инфицирующий бактериальную клетку E. сoli (от. греч фагиен – пожиратель). Вирус содержит ДНК (50 %), заключенную в белковую оболочку. При инфекции бактериальной клетки вирусная частица абсорбируется на клеточной поверхности, фаг прикрепляется к поверхности бактериальной клетки с помощью хвостовых нитей (фибрилл), расщепляет ферментами мембрану клетки и впрыскивает ДНК, белковая оболочка при этом остается на поверхности клетки. Вирусы паразитируют на генетическом уровне, фаговая ДНК разрушает бактериальную ДНК и использует ферментативную систему бактериальной клетки для синтеза вирусных частиц.
После заражения в клетке E. сoli образуются новые вирусные частицы и через 20 мин. при =37 С бактериальная клетка лизируется и около 100 дочерних вирусных частиц, идентичных обычно заразившей клетку частице, выходит наружу.
В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз доказали роль ДНК для синтеза новых вирусных частиц.
Белок фага был помечен радиоактивным изотопом серы 35S, лишь белковая составляющая содержит серу в составе аминокислот метионина и цистеина. ДНК пометили радиоактивным изотопом фосфора 32Р, около 99 % 32Р в фаге приходится на ДНК. Для введения меток, бактериофагом заражали бактериальные клетки, культивируемые в среде, компоненты которой содержали соответствующие изотопы. Меченными бактериофагами заражали клетки E. сoli, не содержащие 35S и 32Р.
Неадсорбированные частицы удаляли методом центрифугирования, Инфицированные бактерии подвергались сильному встряхиванию и разделяли полученный препарат путем центрифугирования на две фракции. Одна фракция содержала пустые фаговые оболочки, отделившиеся от клеточной стенки бактерий, при этом отделяется большая часть меченного белка 35S (75-80 %). Другая фракция – сами бактерии, большая часть меченной 32Р ДНК не отделяется при этом от бактериальной клетки, она оказалась внутри инфицированных бактерий. 20 % фаговой серы, которую не удается отделить от поверхности бактериальной клетки, составляют части отростков, прочно прикрепленных к поверхности бактерии и не отделяющиеся при втсряхивании.
В потомстве фага, образованном после инфицирования было найдено примерно 30 % исходной метки 32Р, а от исходного белка менее 1 %.
Вывод:для образования копий фага в зараженнойбактериальной клетке существенна лишь ДНК родительского фага, тогда как новые фаговые частицы содержат как ДНК, так и белок. Было высказано проедположение, что белковый компонент фага защищает ДНК от расщепляющих ферментов и обеспечивает попадание ДНК в бактериальную клетку, тогда как ДНК представляет сбой собственно вещество наследственности.
Таким образом,на примере бактериофага Т2 еще раз был подтвержден общий вывод о генетической роли ДНК.
Данный эксперимент был признан в качестве решающего доказательства генетической роли ДНК. Было известно, что по характеру наследования признаков бактериофаг аналогичен высшим организмам. Его признаки точно воспроизводятся и подчиняются тем же правилам, что делает возможным линейное картирование мутаций.
К 1952 г было показано, что ДНК обладает достаточной химической сложностью для носителя наследственной информации.
3. Опыты на вирусе табачной мозаики (ВТМ)
ВТМ, как и большинство растительных вирусов, состоит из белка и рибонуклеиновой кислоты (РНК). Каждая частица вируса содержит РНК, состоящую из 6400 нуклеотидов, заключенных в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит примерно из 2130 одинаковых субъединиц, каждая из которых представляет собой цепь из 158 аминокислот. При сборке аминокислот образуется спиральный желобок, в котором укладывается одна одноцепочечная РНК.
С помощью химических методов можно разделить РНК и белок вируса.
Обычно очищенный препарат РНК ВТМ сохраняет не более 0,1 % инфицирующей активности препарата интактного (неповрежденного) вируса. Инфекционность очищенной РНК быстро разрушается рибонуклеазой, не влияющей на инфекционность интактного вируса.
Исследователи Френкель-Конрат и Вильямс обнаружили, что при смешивании расфракционированных и очищенных белка и РНК происходит соединение обеих фракций и образуются морфологически зрелые, полностью инфекционные частицы.
Имеется множество разновидностей ВТМ, различающихся по кругу растений хозяев по вирулентности на разных растениях, между ними существуют различия в аминокислотном составе белков.
стандартный штамм ВТМ (тип S) = белок S + S РНК
(отсутствуют метионин
и гистидин)
штамм Н R = белок Н R + Н R РНК
(имеются метионин
и гистидин)
сконструирован гибридный вирус = очищенный белок Н R + очищенная S РНК
Потомство гибридных вирусов имело тип белковой оболочки, соответствующий типу РНК в сконструированном вирусе. Состав белковой оболочки не наследовался. Он определялся исключительно РНК.
Таким образом, результаты проведенных исследований доказали, что именно нуклеиновые кислоты являются носителем наследственной информации во всех организмах (генетический материал всех организмов, исключая вирусов, представлен ДНК).