Выявление генетических маркеров в реакции гибридизации нуклеиновых кислот

В фильтрационном тесте образцы ДНК денатурируют и наносят на мембрану. Проводят инкубацию фиксированных образцов с меченными ДНК-зондами (изотопы P³²., флюоресценты). Промывают мембрану для удаления не связавшихся зондов. Положительные образцы выявляют путем авторадиографии или в люминесцентном микроскопе. При гибридизации in situ манипуляции с ДНК проводят в интактных образцах ткани, фиксируемых на предметном стекле.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР – исскуственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

Исходные компоненты ПЦР

1. ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент.

2. Праймеры - синтетические олигонкулеотиды (последовательности из 20-35 нуклеотидов), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента.

3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - смесь четырех видов нуклеотидов А, Т, Г, Ц,являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

4. Фермент Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК.

5. Буферный раствор (среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Весь технологический процесс исследования с использованием полимеразной цепной реакции включает:

1) выделение ДНК и ее очистка; 2) проведение полимеразной реакции- умножения (амплификация) фрагментов ДНК возбудителя заболевания; 3) оценку результата

Для проведения ПЦРиспользуется - термоциклер, позволяющей автоматически изменять температурный режим реакционной смеси. Каждый цикл ПЦР включает три этапа (см. схему):

1 этап. ДенатурацияДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при t 93-95^оС в течение 30-40 сек.

2 этап. Присоединениепраймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров своя температура отжига 50-65^оС. Время отжига -20-60 сек.

3 этап. Элонгация (комплементарное достраивание цепей) ДНК происходит от 5’- к 3’-концу цепи , начиная с участков присоединения праймеров. Материал для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты ( дНТФ). Процесс синтеза катализирует термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72^оС. - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации цепи ДНК служат матрицами для второго цикла. Накопление ампликонов в растворе происходит по формуле 2n, где n-число циклов амлификации.

Для получения количества копий искомого фрагмента ДНК, выявляемого с помощью электрофореза или иммунофлюоресцеции необходимо 20-40 циклов.

Бактериофаги - (фаги) – это вирусы, поражающие клетки бактерий. Они не имеют клеточной структуры, неспособны сами синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, поэтому являются облигатными внутриклеточными паразитами. Вирионы фагов состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту вируса, и отростка. Фаги могут существовать в двух формах 1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК); 2) внеклеточной (это вирион).

Выделяют 5 основных типов бактериофагов в зависимости от типа нуклеиновых кислот (ДНК-содержащие и РНК-содержащие фаги), строения, типа симметрии:

1. Нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду.
2. Фаги с аналогом отростка.
3. Фаги с коротким отростком.
4. Фаги с несокращающимся чехлом.
5. ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластиной. Их строение:

Головка фагов имеет кубический тип симметрии, состоит из белковой оболочки, построенной из отдельных субъединиц и заключенного в ней ДНК- генома, размеры головки около 100нм. Геном фагов образован спирально упакованной двойной нитью ДНК.

Отросток (хвост) фагов имеет длину около 100 нм, включает полый стержень, сконструированный по типу спиральной симметрии и сократительный чехол. В дистальном отделе стержня расположена 6-угольная базальная пластина с 6-ю шипами и 6-ю отростками (фибриллами). У некоторых фагов в дистальной части отростка находится фермент лизоцим, растворяющий клеточную стенку бактерии.

По сравнению с вирусами человека бактериофаги более устойчивы к различным физическим и химическим воздействиям. Они хорошо переносят высокие температур (50-60 0С), действие дезинфицирующих средств, УФ-облучение в низких дозах.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой строго специфично, (фаги инфицируют бактерии только определенного вида) и происходит в несколько этапов.

1. Адсорбция на бактериальной клетке происходит за счет наличия на ее поверхности специфических рецепторов для бактериофага. На бактериях, лишенных клеточной стенки, адсорбция не происходит.

2. Инъекция ДНК фага . После адсорбции происходит расщепление фрагмента клеточной стенки лизоцимом, который содержится в капсиде фага. Чехол сокращается и вирусная ДНК впрыскивается в цитоплазму. Фаговая частица в клетку не проникает.

3. Репродукция фага. Происходит в 3 этапа:1) синтез фаговых белков, 2) репликация нуклеиновых кислот, и синтез белков, 3) сборка фага.