Показания для исследования кариотипа пробанда

Реферат

Тема: Цитогенетические методы

Работу выполнила студентка

3-го курса группы 52062/2

Гапеева Виктория Валерьевна

Минск 2017

Цитогенетические методы

Методы основаны на микроскопическом исследовании хромосом человека. Наиболее распространенным методом в цитогенетике является световая микроскопия. Большинство цитогенетических исследований выполняется на делящихся соматических клетках. В ходе исследования оценивается число хромосом и структура хромосом. Цитогенетический метод применяется для определения хромосомных болезней.

Чаще всего для приготовления препаратов используются культуры клеток. Культуру тканей можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобна культура лимфоцитов крови. 1-2 мл венозной крови добавляют к питательной среде с фитогемаглютинином (белок бобовых растений). Фитогемагглютинин вызывает деление лимфоцитов. Далее клеточное деление останавливают на стадии метафазы при помощи колхицина (или других подобных веществ). Далее лейкоциты обрабатывают солевым раствором (гипотонический шок). В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается и хромосомы свободно распределяются в цитоплазме. После приготовления препаратов осуществляется его окраска. Наиболее распространена простая (рутинная) окраска, или окраска по Гимзе. При такой окраске хромосомы окрашиваются равномерно по всей длине. Простой окраски достаточно чтобы подсчитать число хромосом или оценить достаточно крупные хромосомные перестройки. Для точной идентификации хромосомных мутаций используется дифференциальная окраска. При дифференциальном окрашивании хромосомы приобретают поперечнуюисчерченность. Исчерченность выражается в чередовании темных и светлых полос (эу- и гетерохроматические районы). Каждая хромосома имеет характерный только для нее набор полос, что позволяет идентифицировать каждую хромосому и любую хромосомную мутацию. После окрашивания хромосомы изучают с использованием светового микроскопа.

Цитогенетика человеказанимает одно из важнейших мест в медицинской генетике. Объектом цитогенетических исследований служа хромосомы (греч.chroma – ‘цвет’ иsoma– ‘тело’; В. Вальдеер, 1888 г) – структурные элементы ядра клетки, заключающие в себе основную часть наследственной информации. В зависимости от функциональной активности и стадии клеточного цикла в составе хромосом ДНК может быть уложена с различной плотностью. События, развертывающиеся в клетке в процессе митотического деления протекают в закономерной последовательности и составляют пять сменяющихся стадий: интерфаза, профаза, метафаза, анафаза и телофаза. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза, ДНК в них уложена чрезвычайно плотно. Благодаря этому обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Интерфазные хромосомы (хроматин) активно участвуют в процессах транскрипции и репликации.

Форма метафазных хромосом определяется положение первичной перетяжки – центромеры, которая делит ее на две равных или неравных по длине плеча – теломеры. Короткое плеча хромосомы обозначают литерой "p", длинное – "q". Выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.

Соматические клеткичеловека имеют постоянный двойной диплоидный (2n) набор хромосом или кариотип, который составлен из двух одинарных гаплоидных наборов (n), полученных от родителей. В соматических клетках человека диплоидный набор составляют 46 хромосом (22 пары аутосом и пара половых хромосом). Нормальный набор половых хромосом у женщин представлен ХХ и у мужчин – XY хромосомами.В половых клеткахсодержится гаплоидный набор хромосом.

Классификацияравномерно окрашенных хромосом выработана на международных совещаниях в Денвере (1960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все пары аутосом нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22. Половые хромосомы обозначают латинскими буквами X и Y и при кариотипировании помещают в конце раскладки. Расположенные в указанном порядке, все аутосомы распределяются на семь групп, которые различаются между собой по длине и форме составляющих их членов и обозначаются буквами английского алфавита отAдоG. В группеA(1–3) оказываются три пары самых крупных хромосом: 1, 3 – метацентрические хромосомы и 2 – субметацентрическая. ГруппаB(4–5) включает 2 пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6–12) объединяет семь пар субметацентрическихаутосом и не отличающуюся от них Х‑хромосому. В группуD(13–15) входят три пары акроцентрических хромосом, а в группу Е (16–18) – три пары субметацентрических хромосом. ГруппаF(19–20) содержит две пары маленьких метацентрических хромосом, группаG(21–22) – две пары самых мелких акроцентрическиххромосом.Y‑хромосома выделяется как самостоятельная.

С появлением методов дифференциальной окраски (G, Q, C) появилась возможность идентифицировать хромосомы по характерному для каждой пары чередованию светлых (эухроматин) и темных (гетерохроматин) полос, расположенных симметрично в сестринских хроматидах (Париж, 1971).

Каждая хромосома дифференцирована на 2 типа различных районов, так называемые эу- и гетерохроматические районы. Эухроматические, активные районы – содержат весь основной комплекс генов ядра, т.е. участков хромосомной нити, дифференциально контролирующих развитие признаков организма. Гетерохроматические районы образуют дистальные и проксимальные участки хромосомной нити, а также входят в состав внутренних ее частей. Роль гетерохроматических районов хромосом, эволюционно закрепленных в их структуре, в настоящее время активно изучается.

Среди геномныхмутацийвыделяют:

• полиплоидии– увеличение количества хромосом, кратное гаплоидному числуn (3n, 4n и т.д.);
• анеуплоидии– отклонение количества хромосом от эуплоидных чисел. Среди анеуплоидий выделяют:
• моносомии (2n–1) – отсутствие одной хромосомы для соответствующей пары,
• трисомии (2n+1) – наличие 3‑х гомологичных хромосом вместо обычной пары;
• мозаицизм– присутствие более одной популяции клеток с разным числом хромосом у одного и того же человека.

Структуные перестройкимогут бытьсбалансированными, когда порядок расположения сегментов в хромосомах нарушен, но в целом, количества генетического материала не меняется:

• инверсии –поворот участка хромосомы на 180°,
• транслокации– обмен участками хромосом; могут бытьреципрокнымипри взаимном обмене участками между двумя негомологичными хромосомами иробертсоновскими– транслокации между двумя акроцентрическими хромосомами.

Несбалансированныеперестройки возникают при утрате или избытке хромосомного материала:

• делеции – утрата части хромосомы;
• дупликации – удвоение участка хромосомы;
• изохромосомы – хромосомы, состоящие из двух коротких плечей.

Увеличение или потерю хромосомного материала обозначают соответственно знаком "+" или "–", помещаемым перед номером хромосомы (47,XY +21).

Методы цитогенетического анализаделятся на прямые и непрямые. Непрямые методы включают в качестве обязательного этапа культивирование клеток в искусственных питательных средах. Материалом являются лимфоциты периферической крови и пуповинной крови плода, фибробласты кожи и амниотической жидкости, клетки спонтанно абортируемых эмбрионов и зародышевых оболочек. Прямые методы применяются в тех случаях, когда необходим быстрый результат и имеется возможность получить препараты хромосом клеток, делящихся в организме. Источником таких клеток является костный мозг и клетки зародышевых оболочек. Основным объектом цитогенетического исследования прямыми и непрямыми методами являются стадия метафазы митоза и различные стадии мейоза. Метафаза митоза служит основным объектом для анализа хромосомного набора, т.к. именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их аномалий.

Во время митоза каждая хромосома состоит из двух одинаково длинных тонких тяжей, называемых сестринскими хроматидами, сжимающихся в плотные структуры, в связи с чем создается впечатление коротких плечей, поддерживающихся вместе с помощью центромеры. В метафазе, когда их длина самая наибольшая, хромосомы разбиваются на пары. Подобная систематизация хромосом из одной клетки называется кариотипом. При лабораторных исследованиях у каждого пациента анализируется 10–40 метафазных кариотипов. При подозрении на мозаицизм необходимо анализировать как большее число клеток, так и клетки других тканей.

Геномные мутации

1. Полиплоидия (триплоидия 23+23+23=69, тетраплоидия 23+23+23+23=92)

2. Гаплоидия (23 хромосомы)

3. Анеуплоидия:

– Моносомия:	частичная полная	46,ХХ,5р- 45,Х0
– Полисомия:	частичная полная мозаичная	46,XY,21р+ 47,XY,21+ 46,XY/47,XY,21+

Хромосомные аберрации

p – верхние короткие плечи q– нижние длинные плечи

Делецииp–, q– Дупликации p+, q+ Инверсии Изохромосомы Транслокации а) реципрокные б) робертсоновские

Реферат

Тема: Цитогенетические методы

Работу выполнила студентка

3-го курса группы 52062/2

Гапеева Виктория Валерьевна

Минск 2017

Цитогенетические методы

Методы основаны на микроскопическом исследовании хромосом человека. Наиболее распространенным методом в цитогенетике является световая микроскопия. Большинство цитогенетических исследований выполняется на делящихся соматических клетках. В ходе исследования оценивается число хромосом и структура хромосом. Цитогенетический метод применяется для определения хромосомных болезней.

Чаще всего для приготовления препаратов используются культуры клеток. Культуру тканей можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобна культура лимфоцитов крови. 1-2 мл венозной крови добавляют к питательной среде с фитогемаглютинином (белок бобовых растений). Фитогемагглютинин вызывает деление лимфоцитов. Далее клеточное деление останавливают на стадии метафазы при помощи колхицина (или других подобных веществ). Далее лейкоциты обрабатывают солевым раствором (гипотонический шок). В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается и хромосомы свободно распределяются в цитоплазме. После приготовления препаратов осуществляется его окраска. Наиболее распространена простая (рутинная) окраска, или окраска по Гимзе. При такой окраске хромосомы окрашиваются равномерно по всей длине. Простой окраски достаточно чтобы подсчитать число хромосом или оценить достаточно крупные хромосомные перестройки. Для точной идентификации хромосомных мутаций используется дифференциальная окраска. При дифференциальном окрашивании хромосомы приобретают поперечнуюисчерченность. Исчерченность выражается в чередовании темных и светлых полос (эу- и гетерохроматические районы). Каждая хромосома имеет характерный только для нее набор полос, что позволяет идентифицировать каждую хромосому и любую хромосомную мутацию. После окрашивания хромосомы изучают с использованием светового микроскопа.

Цитогенетика человеказанимает одно из важнейших мест в медицинской генетике. Объектом цитогенетических исследований служа хромосомы (греч.chroma – ‘цвет’ иsoma– ‘тело’; В. Вальдеер, 1888 г) – структурные элементы ядра клетки, заключающие в себе основную часть наследственной информации. В зависимости от функциональной активности и стадии клеточного цикла в составе хромосом ДНК может быть уложена с различной плотностью. События, развертывающиеся в клетке в процессе митотического деления протекают в закономерной последовательности и составляют пять сменяющихся стадий: интерфаза, профаза, метафаза, анафаза и телофаза. Митотические хромосомы образуются в клетке во время митоза, ДНК в них уложена чрезвычайно плотно. Благодаря этому обеспечивается равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками при митозе. Интерфазные хромосомы (хроматин) активно участвуют в процессах транскрипции и репликации.

Форма метафазных хромосом определяется положение первичной перетяжки – центромеры, которая делит ее на две равных или неравных по длине плеча – теломеры. Короткое плеча хромосомы обозначают литерой "p", длинное – "q". Выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы.

Соматические клеткичеловека имеют постоянный двойной диплоидный (2n) набор хромосом или кариотип, который составлен из двух одинарных гаплоидных наборов (n), полученных от родителей. В соматических клетках человека диплоидный набор составляют 46 хромосом (22 пары аутосом и пара половых хромосом). Нормальный набор половых хромосом у женщин представлен ХХ и у мужчин – XY хромосомами.В половых клеткахсодержится гаплоидный набор хромосом.

Классификацияравномерно окрашенных хромосом выработана на международных совещаниях в Денвере (1960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Хромосомы располагаются в порядке уменьшения их длины. Все пары аутосом нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22. Половые хромосомы обозначают латинскими буквами X и Y и при кариотипировании помещают в конце раскладки. Расположенные в указанном порядке, все аутосомы распределяются на семь групп, которые различаются между собой по длине и форме составляющих их членов и обозначаются буквами английского алфавита отAдоG. В группеA(1–3) оказываются три пары самых крупных хромосом: 1, 3 – метацентрические хромосомы и 2 – субметацентрическая. ГруппаB(4–5) включает 2 пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6–12) объединяет семь пар субметацентрическихаутосом и не отличающуюся от них Х‑хромосому. В группуD(13–15) входят три пары акроцентрических хромосом, а в группу Е (16–18) – три пары субметацентрических хромосом. ГруппаF(19–20) содержит две пары маленьких метацентрических хромосом, группаG(21–22) – две пары самых мелких акроцентрическиххромосом.Y‑хромосома выделяется как самостоятельная.

С появлением методов дифференциальной окраски (G, Q, C) появилась возможность идентифицировать хромосомы по характерному для каждой пары чередованию светлых (эухроматин) и темных (гетерохроматин) полос, расположенных симметрично в сестринских хроматидах (Париж, 1971).

Каждая хромосома дифференцирована на 2 типа различных районов, так называемые эу- и гетерохроматические районы. Эухроматические, активные районы – содержат весь основной комплекс генов ядра, т.е. участков хромосомной нити, дифференциально контролирующих развитие признаков организма. Гетерохроматические районы образуют дистальные и проксимальные участки хромосомной нити, а также входят в состав внутренних ее частей. Роль гетерохроматических районов хромосом, эволюционно закрепленных в их структуре, в настоящее время активно изучается.

Среди геномныхмутацийвыделяют:

• полиплоидии– увеличение количества хромосом, кратное гаплоидному числуn (3n, 4n и т.д.);
• анеуплоидии– отклонение количества хромосом от эуплоидных чисел. Среди анеуплоидий выделяют:
• моносомии (2n–1) – отсутствие одной хромосомы для соответствующей пары,
• трисомии (2n+1) – наличие 3‑х гомологичных хромосом вместо обычной пары;
• мозаицизм– присутствие более одной популяции клеток с разным числом хромосом у одного и того же человека.

Структуные перестройкимогут бытьсбалансированными, когда порядок расположения сегментов в хромосомах нарушен, но в целом, количества генетического материала не меняется:

• инверсии –поворот участка хромосомы на 180°,
• транслокации– обмен участками хромосом; могут бытьреципрокнымипри взаимном обмене участками между двумя негомологичными хромосомами иробертсоновскими– транслокации между двумя акроцентрическими хромосомами.

Несбалансированныеперестройки возникают при утрате или избытке хромосомного материала:

• делеции – утрата части хромосомы;
• дупликации – удвоение участка хромосомы;
• изохромосомы – хромосомы, состоящие из двух коротких плечей.

Увеличение или потерю хромосомного материала обозначают соответственно знаком "+" или "–", помещаемым перед номером хромосомы (47,XY +21).

Методы цитогенетического анализаделятся на прямые и непрямые. Непрямые методы включают в качестве обязательного этапа культивирование клеток в искусственных питательных средах. Материалом являются лимфоциты периферической крови и пуповинной крови плода, фибробласты кожи и амниотической жидкости, клетки спонтанно абортируемых эмбрионов и зародышевых оболочек. Прямые методы применяются в тех случаях, когда необходим быстрый результат и имеется возможность получить препараты хромосом клеток, делящихся в организме. Источником таких клеток является костный мозг и клетки зародышевых оболочек. Основным объектом цитогенетического исследования прямыми и непрямыми методами являются стадия метафазы митоза и различные стадии мейоза. Метафаза митоза служит основным объектом для анализа хромосомного набора, т.к. именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их аномалий.

Во время митоза каждая хромосома состоит из двух одинаково длинных тонких тяжей, называемых сестринскими хроматидами, сжимающихся в плотные структуры, в связи с чем создается впечатление коротких плечей, поддерживающихся вместе с помощью центромеры. В метафазе, когда их длина самая наибольшая, хромосомы разбиваются на пары. Подобная систематизация хромосом из одной клетки называется кариотипом. При лабораторных исследованиях у каждого пациента анализируется 10–40 метафазных кариотипов. При подозрении на мозаицизм необходимо анализировать как большее число клеток, так и клетки других тканей.

Показания для исследования кариотипа пробанда

1. Множественные врожденные пороки развития и микроаномалии у новорожденных детей и их родителей.

2. Олигофрения, задержка физического и нервно-психического развития в сочетании с врожденными аномалиями.

3. Нарушение дифференцировки пола.

4. Первичная и вторичная аменорея.

5. Бесплодие.

6. Женщины со спонтанными абортами, привычными самопроизвольными абортами, мертворождением.

7. У родственников пробанда первой степени родства, который имеет структурные перестройки хромосом.

Для выявления изменений в системе половых хромосом используются следующие экспресс–методы:

Определение полового Х‑хроматина в интерфазных ядрах клеток буккального эпителия. Каждая клетка содержит только одну генетически активную Х‑хромосому. Цитологическим проявлением неактивной Х‑хромосомы служит хроматиновая масса (тельце Барра), обнаруживаемая на периферии интерфазного ядра. По количеству телец Барра можно судить о количестве неактивных Х‑хромосом. Например, в используемых клетках женского организма (46,ХХ), при синдроме Клайнфельтера определяется 1 тельце Барра. В клетках мужского организма и в большинстве эпителиальных клеток при синдроме Тернера (45,Х0) половой Х‑хроматин отсутствует. Существует эмпирическое правило, согласно которому число телец полового хроматина равно числу Х‑хромосом минус 1 (В=Х–1).

Определение Y‑хроматина. В интерфазном ядре при окраске люминесцентными красителями (Q–метод)Y‑хромосома выглядит ярко флюоресцирующим скоплением хроматина. Пробы на Х- иY‑хроматин не должны служить в качестве абсолютно достоверных для диагностики при патологическом изменении половых хромосом. Окончательный ответ может быть получен только при анализе кариотипа пациента.