III. Регулирующие ход онтогенеза

1. Хроногены

2. Гены пространственной организации

41. Свойства генетического кода

Колинеарность- параллелизм. Нуклеотидная последовательность ДНК соответствует аминокислотной последовательности белка

Триплетность–каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов – триплетом. Из четырех нуклеотидов путем различных сочетаний можно получить 64 триплета - кодона.

Неперекрываемость – перекрываемость – при неперекрываемости один и тот же нуклеотид не может одновременно принадлежать двум кодонам

Перекрываемость – заключается в том, что с одного и того же участка ДНК может считываться информация для образования двух и более белков в зависимости от начальной точки считывания

Вырожденность– экспериментально установлено, что при триплетности все 64 кодона имеют значение в экспрессии генов. Из них 61 кодон кодирует аминокислоты, а3 кодона являются стоп – кодонами: УГА,УАГ,УАА.

Универсальность – кодирование аминокислот происходит одинаково на всех уровнях организации живой системы

Квазиуниверсальность– некоторые кодоны в разных генетических системах кодируют различные аминокислоты

42. Транскрипция, активация и транспорт аминокислот, трансляция

43. Транскрипция, процессинг, активация и транспорт аминокислот, трансляция

44. Инициация. Последовательность ДНК, транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся промотором на 5'-конце и заканчивающаяся терминатором на 3'-конце, является единицей транскрипции и соответствует современному понятию «ген». Контроль экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции. На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор — фрагмент длиной 41-44 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5'—3', или слева направо. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор стартового нуклеотида, а ЦААТ — первичное связывание РНК-полимеразы с ДНК-матрицей

45. Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет ряд аналогий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3'-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование уэукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

46. Терминация. Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках Е. сoli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продвигается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях. Например, 5' ЦЦА ТГГ 3'

3' ГГТ АЦЦ 5'

47. процессинг – созревание г/я РНК и превращение ее в иРНК. Происходит в ядре. Участвует органоид ядра – сплайсосом. Наиболее важными в процессинге являются следующие моменты:

1) сплайсинг(сшивание). Сплайсосома охватывает интронный участок молекулы г/я РНК и втягивает его в виде петли внутрь. Экзоные участки сближаются и сшиваются ферментом лигазой. Затем фермент рестриктаза отрезает неинформативный участок. Образуется РНК, несушая только информативные участки.

2) Защита концов

48. Функциональные центры рибосом

1 сентября 2008 пишет katrinx в категории Молекулярная биология

Собственно процесс трансляции начинается со сборки активной рибосомы, что обозначается как инициация трансляции. Эта сборка происходит строго упорядоченным образом, что обеспечивается функциональными центрами рибосом.

Поэтому, чтобы понять последовательность сборки и сам ход трансляции, необходимо вначале рассмотреть данные центры.

Все эти центры находятся на контактирующих поверхностях обеих субъединиц рибосомы.

Вообще говоря, форма субъединиц рибосом, а также их контактирующих поверхностей весьма сложная.бранная рибосома до известной степени напоминает по форме сердце (без полостей), правые отделы которого образованы малой субъединицей, а левые (более объемные) — большой субъединицей. Причем между теми и другими находится не перегородка, а серия небольших полостей — углублений в контактирующих поверхностях. В этих полостях располагаются в собранной рибосоме другие участники трансляции — мРНК, пептидил-тРНК (синтезированный на данный момент пептид, связанный с тРНК) и очередная амино-ацил-тРНК.

Соответственно, на контактирующих поверхностях имеются центры связывания этих компонентов, а также центры, катализирующие образование пептидной связи и постепенное пере-' мещение рибосомы относительно мРНК.

Таким образом, рибосома в собранном виде, хотя и включает около 80 макромолекул, является фактически суперферментом. Действительно, как и обычные ферменты, она

- во-первых, правильно ориентирует участников процесса друг относительно друга,

- а во-вторых, катализирует определенные реакции между ними.

В дальнейшем (для простоты) мы будем представлять субъединицы рибосом в виде двух шаровых сегментов. И, чтобы показать взаимное расположение центров, вначале спроецируем последние на условную плоскость между субъединицами.

Тогда на этой плоскости окажется следующее.

а) Центр связывания мРНК (М центр). Он образован участком 18S-pPHK, который комплементарен на протяжении 5-9 нуклеотидов 5'-нетранслируемому фрагменту мРНК.

б) Пептидильный центр (П-центр). В начале процесса трансляции с ним связывается инициирующая аа-тРНК. У эукариот инициирующий ко дон всех мРНК всегда кодирует метионин. Поэтому инициирующей аа-тРНК является одна из двух метиониновых аа-тРНК, отмечае-Метмая нижним индексом i: Мет-тРНК.

На последующих же стадиях трансляции в П-центре находится пептидил-тРНК, содержащая уже синтезированную часть пептидной цепи.

Иногда говорят также о Е-центре (от «exit» — выход), куда перемещается тРНК, потерявшая связь с пептидилом, перед тем, как покинуть рибосому. Однако мы будем рассматривать этот центр как составную часть Р-центра.

в) Аминокислотный центр (А-центр) — место связывания очередной аа-тРНК.

г) И, наконец, пептидилтрансферазный центр (ПТФ-центр): он катализирует перенос пептидила из состава пептидил-тРНК на поступившую в А-центр очередную аа-тРНК.

При этом образуется еще одна пептидная связь и пептидил удлиняется на одну аминокислоту.

Как в А-, так и в П-центре антикодоновая петля соответствующей тРНК (аа-тРНК или пептидил тРНК), очевидно, обращена к М-центру (взаимодействуя с мРНК), а акцепторная петля с аминоацилом или пептидилом к ПТФ центру.

Итого 4 основных центра. Как же они распределяются между малой и большой субъединицами рибосомы? Малая субъединица. Поскольку именно она содержит 18S-рРНК, с участком которой связывается мРНК, то М-центр расположен на данной субъединице.

Кроме того, здесь же находятся основная часть А-центра и небольшая часть П-центра.

Большая субъединица. На ее контактирующей поверхности расположены остальные части П- и А-центров. В случае П-центра — это его основная часть, а в случае А-центра — участок связывания акцепторной петли аа-тРНК с аминокислотным радикалом (аминоацилом); остальная же и большая часть аа-тРНК связывается с малой субъединицей.

Большой субъединице принадлежит также ПТФ-центр.

Всеми этими обстоятельствами и определяется порядок сборки рибосомы на стадии инициации трансляции.

49. Транспортная РНК, тРНК — рибонуклеиновая кислота, функцией которой является транспортировка аминокислот к месту синтеза белка. Имеет типичную длину от 73 до 93 нуклеотидов и размеры около 5 нм.тРНК также принимают непосредственное участие в наращивании полипептидной цепи, присоединяясь — будучи в комплексе с аминокислотой — к кодону мРНК и обеспечивая необходимую для образования новой пептидной связи конформацию комплекса.

Для каждой аминокислоты существует своя тРНК.

тРНК является одноцепочечной РНК, однако в функциональной форме имеет конформацию «клеверного листа». Аминокислота ковалентно присоединяется к 3'-концу молекулы с помощью специфичного для каждого типа тРНК фермента аминоацил-тРНК-синтетазы. На участке C находится антикодон, соответствующий аминокислоте.

тРНК синтезируются обычной РНК-полимеразой в случае прокариот и РНК-полимеразой III в случае эукариот. Транскрипты генов тРНК подвергаются многостадийному процессингу, который в конце концов приводит к формированию типичной для тРНК пространственной структуры. Процессинг тРНК включает 5 ключевых этапов[1]:

удаление 5'-лидерной нуклеотидной последовательности;

удаление 3'-концевой последовательности;

добавление последовательности CCA на 3'-конец;

вырезание интронов (у эукариот и архей);

модификации отдельных нуклеотидов.

По окончании созревания эукариотические тРНК должны быть перенесены в цитоплазму, где они участвуют в биосинтезе белка. Транспорт тРНК осуществляется по Ran-зависимому пути при участии транспортного фактора экспортина t (Los1 у дрожжей), который распознаёт характерную вторичную и третичную структуру зрелой тРНК: короткие двуспиральные участки и правильно процессированные 5'- и 3'-концы. Такой механизм обеспечивает экспорт из ядра только зрелых тРНК. Предположительно, экспортин 5 может быть вспомогательным белком, способным переносить тРНК через ядерные поры наряду с экспортином t[2].

50. Инициация трансляции

Инициация трансляции - это серия молекулярных событий, происходящих с рибосомой, которая приводит к взаимодействию рибосомы с началом кодирующей нуклеотидной последовательности мРНК и последующему считыванию (трансляции) этой последовательности.

У E.coli трансляция начинается с образования комплекса между малой субъединицей, мРНК, заряженной тРНК, GTP, неорганическим магнием (Mg2+) и тремя факторами инициации (IF), усиливающими сродство (аффинность) различных компонентов трансляционного комплекса.

Инициирующим кодоном мРНК у прокариот является AUG, соответствующий модифицированной аминокислоте — формилметионину (fmet). Метионин, присоединяемый к инициаторной тРНК, подвергается формилированию по NH2-группе. Этот процесс катализирует трансформилаза, использующая N(10)-формилтетрагидрофолат в качестве донора формильной группы. Инициаторная аминоацил-тРНК имеет структурные особенности, которые распознаются фактором инициации IF2, доставляющим инициаторную аминоацил-тРНК к формирующемуся инициаторному комплексу.

Способность рибосомы к трансляции матричного полинуклеотида (мРНК) и направляемому ей синтезу полипептидной цепи белка не обеспечивает пути вхождения в эти процессы. Синтез полипептида требует присутствия предобразованной пептидил-тРНК в качестве одного из субстратов реакции транспептидации. Другими словами, донорный субстрат должен присутствовать в рибосомном Р-участке, чтобы далее удлиняться за счет присоединения следующего аминоацильного остатка. Но когда рибосома начинает трансляцию, никакого пептида и соответствующего донорного субстрата в виде пептидил-тРНК в рибосоме еще нет.

Для того чтобы решить эту проблему и запускаются специальные механизмы инициации: специальная инициаторная аминоацил-тРНК во взаимодействии со специальными белками (факторами инициации) связывается со специальным инициирующим участком мРНК на рибосоме. При этом связывающаяся инициаторная аминоацил-тРНК поступает именно в Р-участок рибосомы, что позволяет ей служит в качестве донорного субстрата в образовании первой пептидной связи. Таким образом, инициаторная аминоацил-тРНК в Р-участке рибосомы имитирует пептидил-тРНК, что и позволяет решить трудность начала элонгации пептида. У прокариотических организмов (бактерий) инициаторная аминоацил-тРНК похожа на пептидил-тРНК также и химически: ее аминогруппа формилирована, то есть связана с формильной группой амидной связью. Итак, введение донорного субстрата в Р-участок рибосомы и есть одна из основных функций механизма инициации трансляции.

Инициация трансляции означает не просто начало синтеза полипептидной цепи, то есть элонгационного процесса. Инициация — это также и начало считывания мРНК, которое должно всегда осуществляться со строго фиксированной определенной точки матричного полинуклеотида. Это начало считывания - никогда не начало полинуклеотидной цепи мРНК (то есть не ее 5'-конец), а всегда находится несколько или даже много отступя от начала цепи. Следовательно, требуется механизм точного узнавания первого кодона на мРНК, чтобы начать синтез полипептида именно с его первого аминокислотного остатка.

Узнавание рибосомой стартовой точки трансляции мРНК должно быть очень точным еще по одной причине. Рибосома читает кодоны мРНК строго последовательно, триплет за триплетом, и это устанавливает так называемую рамку или фазу считывания. Никаких "пробелов" или "запятых" между триплетами нет: их правильное считывание определяется только изначально заданной триплетной рамкой. Поэтому начало потриплетного считывания одним нуклеотидом раньше или одним нуклеотидом позже привело бы к сдвигу рамки, а тем самым не только к утрате первой аминокислоты пептида, но и к полной бессмысленности всей остальной аминокислотной последовательности. Таким образом, строгое, безошибочное нахождение рибосомой первого кодона определяет и старт, и рамку трансляции мРНК, и это есть еще одна фундаментальная функция механизма инициации.

Наконец, третий важнейший аспект при рассмотрении функциональной значимости механизма инициации - это его ключевая роль в регуляции биосинтеза белка на уровне трансляции. Именно инициация является точкой приложения регуляторных механизмов, определяющих интенсивность трансляции различных мРНК и, следовательно, продукцию соответствующих белков в клетке, а также прекращение трансляции под действием определенных внутриклеточных сигналов или, наоборот, индукцию трансляции прежде "молчавших" мРНК. Регуляция биосинтеза белка на уровне трансляции может быть рассмотрена как разрешение или запрещение инициации на данной мРНК. Этим путем достигается избирательная или преимущественная трансляция лишь определенных мРНК и, наоборот, трансляционная инактивация других мРНК.Кроме того, различные скорости инициации на различных мРНК определяют необходимые соотношения продукции разных белков.

51. Элонгация трансляции

Элонгация - это и есть собственно трансляция кодирующей последовательности мРНК рибосомой. Она имеет два аспекта: генетический (сканирование значащих кодонов мРНК) и биохимический (синтез полипептидной цепи).

В собранной из двух субъединиц рибосоме есть два сайта для заряженных тРНК: P-сайт (пептидильный) и A-сайт (аминоацильный). Если триплет AUG находится в нужной позиции, то инициаторная тРНК связывается с P-сайтом на малой субъединице.

Последовательность второго триплета мРНК определяет, какая тРНК свяжется с A-сайтом. После связывания соответствующей тРНК с этим сайтом пептидилтрансфераза, входящая в состав большой субъединицы рибосомы, катализирует образование пептидной связи между двумя аминокислотами. Одновременно происходит гидролиз ковалентной связи между аминокислотой и тРНК, связанной с P-сайтом. В результате образуется дипептид, присоединенный к 3'-концу тРНК, находящейся в A-сайте.

После того как произошла инициация трансляции, рибосома осуществляет прочный комплементарный контакт связанных с ней молекул аминоацил-тРНК - инициаторной метионил-тРНК в Р-участке рибосомы и первой "элонгаторной" аминоацил-тРНК в А-участке - с двумя смежными триплетами (кодонами) мРНК (рис. 4, а ). В таком состоянии происходит реакция транспептидации между этими двумя аминоацил-тРНК, результатом чего является образование дипептидил-тРНК, связанной с триплетом (кодоном) в А-участке рибосомы (рис. 4, б ). При последующей транслокации остаток тРНК этой молекулы дипептидил-тРНК двигается из А-участка в Р-участок, таща за собой связанный с ней триплет мРНК (рис. 4, в ). В итоге цепь мРНК протаскивается относительно рибосомы ровно на один триплет нуклеотидов, и теперь в А-участке устанавливается смежный с предыдущим триплет нуклеотидов, то есть следующий кодон.

Далее события происходят аналогичным образом:

аминоацил-тРНК, соответствующая (комплементарная) вновь установленному в А-участке кодону, связывается из окружающей рибосому среды с этим кодоном в А-участке (рис. 4, г );

дипептидил-тРНК в Р-участке реагирует с новоявленной аминоацил-тРНК в А-участке путем транспептидации, что приводит к образованию трипептидил-тРНК в А-участке (рис. 4, д );

транслокация перебрасывает остаток тРНК молекулы трипептидил-тРНК из А-участка в Р-участок вместе со связанным с ней триплетом мРНК (рис. 4, е ). За этим следует аналогичный ряд событий (1-3), начинающийся с комплементарного связывания очередной аминоацил-тРНК с новым кодоном в А-участке.

Каждый раз вслед за связыванием аминоацил-тРНК с А-участком рибосомы происходит реакция транспептидации между этой аминоацил-тРНК (акцепторный субстрат) и сидящей в Р-участке молекулой пептидил-тРНК (донорный субстрат). Реакция приводит к замещению остатка тРНК в молекуле пептидил-тРНК на остаток аминоацил-тРНК, так что аминогруппа аминоацил-тРНК образует пептидную связь с карбоксильной группой пептидильного остатка:

NH2CH(CH2CH2SCH3)CO-NHCH(R')CO-tRNA' + NH2CH(R")CO-tRNA" >> NH2CH(CH2CH2SCH3)CO-NHCH(R')CO-NHCH(R")CO-tRNA" + tRNA'

Таким образом, в процессе элонгации в каждом шаге прочитывания триплета и транспептидации новый аминокислотный остаток добавляется к карбоксильному концу (или С-концу) пептида. Другими словами, рост пептида в рибосоме идет от N-конца к С-концу.

В цитоплазме есть два белковых фактора элонгации. Они являются G-белками, которые в комплексе с молекулой GTP связываются с рибосомами. Оба белка представляют собой GTPазы. На рибосоме они гидролизуют связанную молекулу GTP до GDP и Pi; освобождение последнего вызывает конформационные изменения в данных белках. В комплексе с GDP они отсоединяются от рибосомы. В цитоплазме GDP обменивается на GTP, и факторы готовы участвовать в следующем этапе элонгации. Этими двумя факторами являются EF-Tu (нетермостабильный фактор элонгации, elongation factor temperature unstable) и EF-G. Задача EF-Tu состоит в доставке аминоацил-тРНК к рибосоме. Как только аминоацильная группа добавится к растущему пептиду, EF-G способствует продвижению рибосомы по мРНК в направлении 5'-3' к следующему кодону. Эти два фактора попеременно двигаются по рибосоме в GTP-связанном состоянии, выполняют свои задачи и отсоединяются в GDP-связанном состоянии, чтобы затем повторно участвовать в последующих раундах элонгации.

Аминоацил-тРНК образуют комплекс с фактором элонгации EF-Tu, связанным с молекулой GTP. Комплекс EF-Tu-GTP-аминоацил-тРНК связывается с рибосомой таким образом, что аминоацил-тРНК занимает А-участок, а ее антикодон располагается у кодона мРНК. EF-Tu-GTP не связывается с fMet-тРНКf (инициаторной тРНК), а взаимодействует только с аминоацил-тРНК, участвующими в элонгации. На рибосоме EF-Tu, обладающий GTPазной активностью, гидролизует связанную молекулу GTP до GDP и Pi, высвобождая последний. Это служит сигналом для отделения EF-Tu от аминоацил-тРНК вследствие аллостерических изменений, а EF-Tu-GDP покидает рибосому для регенерации в ходе обмена GDP-GTP в цитоплазме.

Пространственная структура домена IV полипептидной цепи фактора элонгации EF-G имитирует структуру тРНК в ее комплексе с другим фактором элонгации EF-Tu. При этом структура соответствующей части полипептидной цепи EF-G напоминает форму антикодоновой петли тРНК в комплексе с фактором элонгации, ее положение относительно коровой части EF-Tu и даже распределение электростатических зарядов на поверхности полипептида, которое соответствовало таковому углевод-фосфатного остова тРНК. Это открытие позволяет по-новому смотреть на механизм действия EF-G в процессе трансляции. Такого рода данные позволили предположить, что домен IV фактора EF-G занимает во время некоторых этапов транслокации ту же часть А-участка рибосом, что и тРНК.

Аминоацильные группы на двух молекулах тРНК, расположенных в P- и A-участках, находятся вблизи рибосомной пептидилтрансферазы, которая катализирует перенос fMet от тРНК, расположенной в P-участке, на свободную аминогруппу аминоацил-тРНК в А-участке, образуя дипептид, присоединенный к тРНК.

После синтеза первой пептидной связи А-участок заполнен пептидил-тРНК (тРНК, несущая растущую полипептидную цепь), а P-участок содержит ненагруженную тРНК. Рибосома передвигается на один кодон вдоль мРНК (этот процесс называется транслокацией). Освободившаяся от аминокислоты первая тРНК проходит через третий, E-сайт (от exit — выход), т.е. комплекс мРНК-тРНК-аминокислота 2-аминокислота 1 продвигается в направлении к P-сайту на один шаг, равный трем нуклеотидам. Для движения рибосомы по мРНК необходим фактор EF-G (транслоказа) и энергия, которая освобождается при гидролизе GTP. В результате, уже третий триплет мРНК перемещается в A-сайт, акцептируя соответствующую аминоацил-тРНК. После одного сдвига, или шага рибосомы, в P-сайте находится тРНК с растущей полипептидной цепью, а в A-сайте — тРНК с аминокислотой.

У прокариотических организмов (бактерий), где ДНК не отделена мембраной от цитоплазмы и присутствующих там рибосом, последние начинают трансляцию на цепях мРНК, еще находящихся в стадии роста на комплексах ДНК с РНК-полимеразами (рис. 5). Другими словами, молекулы РНК-полимеразы ползут по ДНК и синтезируют цепи мРНК, начиная от 5'-конца РНК в направлении к 3'-концу, а рибосомы присоединяются к свешивающимся с полимераз 5'-концевым участкам, инициируют трансляцию и двигаются в процессе элонгации по направлению к молекуле полимеразы. Это явление получило название сопряженной транскрипции-трансляции. В бактериальных клетках скорость синтеза РНК (транскрипции) - около 30-45 нуклеотидов в секунду при 37°С - строго координирована со скоростью трансляции - около 10-15 триплетов в секунду, так что один триплет нуклеотидов синтезируется приблизительно за то же время, за которое он прочитывается и образуется одна пептидная связь. Таким образом, сопряжение транскрипции и трансляции у прокариот осуществляется как в пространстве (комплекс ДНК :РНК-полимераза: мРНК), так и во времени (координация скоростей транскрипции и трансляции).

Уэукариот сопряжение транскрипции и трансляции невозможно. Во-первых, ДНК (хромосомы) эукариот отделены от цитоплазмы, содержащей рибосомы, ядерной мембраной. Эукариотическая мРНК синтезируется полностью в клеточном ядре, а лишь затем транспортируется из ядра в цитоплазму, где и встречается с рибосомами. Во-вторых, для инициации трансляции мРНК эукариотическими рибосомами требуется не только 5'-концевая часть мРНК, но и готовая 3'-концевая часть, являющаяся "усилителем" инициации. В отличие от бактерий скорость элонгации уэукариот варьирует в широких пределах, обычно от 1 до 10 триплетов в секунду, в зависимости от типа клеток, их физиологического состояния и природы транслируемой мРНК, будучи регулируема с помощью каких-то пока неизвестных клеточных механизмов.

Итак, точкой роста пептида в рибосоме является его С-конец и, следовательно, в течение роста пептида его N-конец все более отодвигается от точки роста, то есть от пептидилтрансферазного центра рибосомы. Довольно скоро N-концевой сегмент растущего пептида высовывается из рибосомы в окружающую ее среду. Показано, что рибосома может вмещать не более чем 10-30 аминокислотных остатков растущего полипептида, считая от его С-конца или пептидилтрансферазного центра. Как правило, полные полипептидные цепи синтезируемых рибосомой белков состоят из 100-300 и более аминокислотных остатков. Это значит, что через какое-то время после начала трансляции N-концевая часть растущего полипептида оказывается вне рибосомы и затем по мере роста полипептида все большая часть его свешивается с рибосомы в среду.

Поскольку рибосому окружает физиологическая среда, а не денатурирующий раствор, полипептидная цепочка в такой среде не может оставаться в виде развернутой цепи: ее гидрофобные боковые группы взаимодействуют друг с другом, а гидрофильные - с окружающей водой и ионами. Это создает условия для сворачивания, компактизации и самоорганизации внерибосомной части растущего полипептида в пространственную (вторичную и третичную) структуру. Следовательно, сворачивание полипептида в компактную структуру происходит по мере его роста, то есть в течение трансляции, а значит, тоже полярно, от N-конца к С-концу. Такое постепенное полярное сворачивание растущей полипептидной цепи на рибосоме обозначается как котрансляционное формирование структуры белка (котрансляционное сворачивание). Рис. 6 иллюстрирует это на примере котрансляционного формирования глобулярной структуры глобина - суВ некоторых случаях белок, синтезируемый рибосомой, не предназначен для немедленного использования в клеточной цитоплазме, а должен быть сначала транспортирован через мембрану либо вне клетки, либо в одну из внутриклеточных органелл (например, в митохондрию или хлоропласт). Транспорт белков через мембрану требует несвернутого состояния их полипептидной цепи. В таких случаях используются две альтернативные стратегии:

рибосомы, синтезирующие белок, предназначенный для транспорта через мембрану, сами сидят на мембране (мембраносвязанные рибосомы), и растущий полипептид в развернутом виде поступает из них непосредственно в мембрану;

свободные (не прикрепленные к мембране) рибосомы цитоплазмы синтезируют полипептидную цепь, которая по мере выхода из рибосомы взаимодействует со специальными белками - молекулярными шаперонами. Шапероны препятствуют полному сворачиванию белка в компактную структуру и поддерживают его недосвернутое состояние в растворе. После освобождения из рибосомы эти недосвернутые белки взаимодействуют с мембраной и транспортируются через нее. Поддержание недосвернутого состояния белков шаперонами может требоваться также и для интеграции этих белков в надмолекулярные структуры клетки, для сборки четвертичных структур сложных белков, для вступления в комплексы с некоторыми лигандами и т.п. В этих случаях белки досворачиваются уже в составе указанных структур и комплексов.бъединицы гемоглобина, кислородпереносящего белка крови.

52. Терминация трансляции

Сканируя цепь мРНК по триплетам и соответственно удлиняя полипептидную цепь, транслирующая рибосома доходит до конца кодирующей последовательности и встречается с одним из трех триплетов, не кодирующих аминокислоты и обозначаемых как стоп-кодоны, или кодоны терминации - UAG, UAA или UGA. В результате завершающей транслокации полипептидил-тРНК оказывается связанной с последним значащим триплетом в Р-участке рибосоме, а в А-участке устанавливается кодон терминации (рис. 7, а ). В клетке нет аминоацил-тРНК, способных комплементарно связываться с терминирующим кодоном, и потому А-участок не заполняется обычным акцепторным субстратом, каковым является аминоацил-тРНК. Вместо этого в дело вступают специальные белки, называемые факторами терминации, или факторами освобождения (release factors, RF). Один из них, RF1 (или похожий на него RF2), взаимодействует непосредственно с кодоном терминации в А-участке, а другой, RF3, при содействии первого и с участием ГТФ - с большой субчастицей рибосомы (рис. 7, б ) и, возможно, непосредственно с пептидилтрансферазным центром. Результатом связывания этих факторов с рибосомой является наведение гидролазной активности в рибосоме: пептидилтрансферазный центр рибосомы катализирует реакцию взаимодействия полипептидил-тРНК как донорного субстрата с молекулой воды как акцепторным субстратом:

NH2CHR'CO-(NHCHRCO)n-NHCHR*CO-tRNA* + H2O >> NH2CHR'CO-(NHCHRCO)n-NHCHR*COOH + tRNA*

Таким образом, связь между синтезированным полипептидом (его С-концом) и тРНК гидролизуется и полипептид уже не удерживается в рибосоме и освобождается в раствор в виде готового белка.

Заключительным актом терминации является выход деацилированной тРНК из Р-участка и диссоциация рибосомы на субчастицы. Диссоциация происходит спонтанно вследствие ослабления связи между двумя рибосомными субчастицами в отсутствие лигандов (пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК), и у бактерий может значительно ускоряться под действием специального белка, называемого фактором освобождения рибосом.

После диссоциации терминировавшей рибосомы на субчастицы малая субчастица не обязательно покидает мРНК: она может задержаться на ней и в случае полицистронных мРНК упрокариот проскользнуть по цепи мРНК до начала следующей кодирующей последовательности и инициировать новую трансляцию (реинициация). Так как малая субчастица до инициации слабо удерживается на мРНК, то, если ей нечего реинициировать на этой же цепи мРНК, она скоро соскочит с нее и окажется среди пула свободных субчастиц цитоплазмы, готовых к инициации трансляции других мРНК.

Имеется три стоп-кодона: UAG, UAA и UGA (терминирующие, или нонсенс-кодоны). Один или несколько этих кодонов, располагаются в A-сайте, терминируют трансляцию. Эти триплеты не кодируют аминокислот и не служат для сявзывания тРНК. Синтезированный полипептид некторое время связан с последней тРНК в P-сайте (A-сайт не занят). Затем факторы терминации способствуют отделению готового полипептида от тРНК, вызывая изменение пептидилтрансферазы, в результате которых последняя гидролизует эфирную связь между COOH-группой белка и OH-группой 3'-концевого нуклеотида. Рибосома отделяется от мРНК и диссоциирует на субъединицы, готовые к следующей инициации.

Для того, чтобы рибосома оставшегося комплекса рибосома-мРНК-тРНК могла вступить в следующий цикл трансляции, она должна освободиться из него. Установлено, что рибочомные рилизинг-факторы (RF) совместно с фактором EF-G при участии молекулы GTP обеспечивают диссоциацию комплекса на составные компоненты, которые затем вступают в новый раунд белкового синтеза. Фактор RF4 (иначе называемый RRF — ribosome-recykling factor) не имеет аналога у эукариот. Его роль заключается в стимуляции перемещения молекулы деацилированой тРНК из Р-участка в Е-участок рибосомы и (или) удалении оставшегося RF-фактора из А-участка. Это способствует полному освобождению рибосомы и ее вовлечению в новый в новый цикл трансляции в результате инициации или реинициации синтеза белка. Рилизинг-фактор RF4 предотващает распознавание аминоацилированной тРНК кодона, находящегося в А-участве рибосомы, который в мРНК следует за терминирующим. Отделившаяся от мРНК рибосома перед вступлением в новый цикл диссоциирует на две субчастицы под действием фактора инициации трансляции IF3. Альтернативно, в том случае, если новый инициирующий кодон полицистронной матрицы находится достаточно близко от стоп-кодона, синтез белка может быть реинициирован.