Паразитологическое исследование (4 часа)

Содержание. Освоение общих положений и порядка полного паразитологического вскрытия рыб.

Материальное обеспечение. Микроскоп * с объективами ×8-9, ×40, ×90, окулярами ×7, ×10, ×15, фазово-контрастное устройство, бинокулярный стереоскопический микроскоп типа МБС с окулярами ×6, ×8, ×12,5 или препаровальная лупа с окулярами ×l0, ×20, стекла для вскрытия размером 6×9 и 9×12 см, предметные и покровные стекла со шлифовальным краем для изготовления мазков крови, препаровальные иглы разной толщины и заточки
(2-3), пинцеты с толстыми и тонкими концами, ножницы хирургические и глазные, скальпели
разных размеров и формы, пипетки разные (с грушевидным баллоном, глазные, пастеровские), эмалированные кюветы (1-2), чашки Петри (10), лабораторные солонки ((3-4), материальные банки для хранения мазков с простейшими, часовые стекла, иммерсионное или вазелиновое масло, вата, марля, фильтровальная бумага, тушь, пергаментная бумага, кисточки, карандаши, весы, измерительная доска, принятая в ихтиологии, сантиметровая линейка, штангенциркуль, лимоннокислый натрий 5 %-ный, метиловый спирт, этиловый спирт 70°-ный, формалин 4 %-ный, жидкость Шаудина.

Для паразитологического исследования используют живых или только что уснувших рыб всех возрастных категорий. Берут следующее количество рыб: мальков 25 экз., сеголетков – 15-5 экз., годовиков – 10-15 экз., остальных возрастных групп по 3-5 экз. При этом используют специальные инструменты (рисунок 4).

Исследование проводят в следующем порядке: кожа, плавники, рото­вая полость, жабры, глаза, кровь, сердце, брюшная полость (печень, селе­зенка, плавательный пузырь, мочевой пузырь, желчный пузырь, почки, поло­вые железы, кишечник), мышцы, головной и спинной мозг.

Результаты исследований вносят в рабочий журнал, где указывают дату, место вылова рыбы, пол, возраст, массу и длину рыбы, данные паразито­логического исследования с предварительным и окончательным определением паразитов.

Рисунок 4 – Набор инструментов и посуды, необходимой для проведения полного паразитологического анализа

Для обнаружения трипанозом и криптобий у рыбы берут кровь из серд­ца и делают мазки.

Для предотвращения свертывания крови добавляют 1 %-ный раствор лимоннокислого натрия, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Чтобы мазок не высыхал, края покровного стекла смазывают вазелином. Одновременно несколько мазков крови высушивают на воздухе, фиксируют в метиловом спирте, окрашивают по Романовскому-Гимзе или гематоксили­ном и микроскопируют.

Обычно определяют длину тела рыбы от переднего конца головы до конца чешуйчатого покрова, т.е. промысловую длину (l) и определяют массу рыбы. Позднее, пользуясь этими данными, определяют коэффициент упитанности по формуле:

K = P × 100 / l³

где:

К – коэффициент упитанности;

P – масса рыбы, г;

l – длина тела до конца чешуйчатого покрова, см.

Кожный покров. При наружном осмотре кожного покрова и плавников собирают всех паразитов, видимых простым глазом: паразити­ческих ракообразных, пиявок, нематод и других (их предварительно опре­деляют и фиксируют для последующего изучения). Затем скальпелем сни­мают слизь со всей поверхности тела (мальки, сеголетки, годовики) или с нескольких участков (крупные рыбы) и с плавников, микроскопируют, помещают ее на предметное стекло и смешивают с 2-3 каплями прокипя­ченной и остуженной воды. Накрывают покровным стеклом и просматривают сначала под лупой, а затем под малым увеличением микроскопа. Возбуди­теля костиоза можно обнаружить только при среднем увеличении микроскопа. Кроме возбудителей костиоза, на коже рыб паразитируют другие жгутиконосцы, инфузории, моногенетические сосальщики и др. Обнаруживают также споровиков, локализирующихся в дермальных бугорках. Под кожей, в подчешуйных кармашках и в лучах хвостового и спинного плавников иногда находят нематод.

Крупных паразитов (рачков, гельминтов) подсчитывают в абсолютных числах, а мелких (споровиков, инфузорий и других простейших) – в отно­сительных, то есть учитывают число паразитов в десяти полях зрения мик­роскопа и определяют средние показатели. При этом высчитывают экстенсив­ность и интенсивность заражения каждым паразитом в отдельности для рыб каждого вида и возраста.

При осмотре кожного покрова можно видеть пигментированные пятна (черного цвета). В этих местах в толще кожи локализуются метацеркарии Posthodiplostomum cuticula. На плавниках встречаются цисты сосальщика рода Bucephalus.

После кожного покрова обследуют жаберный аппарат. Жабер­ные дужки помещают на предметное стекло, всех паразитов, видимых про­стым глазом, подсчитывают и фиксируют. С жаберных лепестков делают соскоб или берут жаберные дужки и с несколькими каплями воды зажи­мают между двумя предметными стеклами до прозрачности и исследуют под малым увеличением микроскопа.

Споровики, некоторые инфузории и личинки сосальщиков могут быть и в соединительных образованиях (бугорках); обнаружить и извлечь их мож­но только после разрыва стенки бугорка с помощью препаровальной иглы. В кровеносных сосудах жабр встречаются яйца сангвиникол, споры и мице­лий гриба.

Глаза. Для обнаружения паразитов (личинок сосальщиков) глаза из­влекают из глазных впадин, кладут на предметное стекло и вскрывают острыми ножницами с внутренней стороны. Стекловидное тело, хрусталик и содержимое передней камеры глаза помещают между двумя предметными стеклами и просматривают под малым увеличением микроскопа.

Брюшная полость. Дугообразный разрез к основанию левого груд­ного плавника ведут от анального отверстия, вводят непосредственно в него тупой конец одной из бранш ножниц. Вскрытую брюшную полость осматри­вают, крупных паразитов извлекают, а имеющиеся на сероз­ных покровах и брыжейке бугорки микроскопируют.

Сердце вынимают вместе с крупными сосудами, помещают в бактериологическую чашку с физиологическим раствором, вскрывают его полости, промывают образовавшийся осадок и микроскопируют на наличие возбуди­теля сангвиниколеза и некоторых метацеркариев.

Печень. При наружном осмотре печени можно обнаружить на ее поверхности личинок круглых червей и белые бугорки с заключенными в них личинками ленточных червей. Чтобы обнаружить паразитов, обитающих внутри печени, ее делят на небольшие кусочки, компрессируют и исследуют под лупой, а затем под малым увеличением микроскопа.

Желчный пузырь вырезают, помещают на предметное стекло, разрезают ножницами, делают соскоб с внутренней оболочки стенки пузыря. Соскоб и сам желчный пузырь помещают между двумя предметными стеклами и исследуют под лупой или микроскопом. В желчном пузыре можно обнаружить простейших сосаль­щиков и личинок ленточных червей.

Селезенкуисследуют так же, как печень.

Почки. Для обнаружения паразитов кусочки органа помещают между стеклами и исследуют под микроскопом. В почках можно найти крупных паразитов, споровиков, яйца сосальщиков, занесенных током крови.

Плавательный пузырь. Наружную волокнистую оболочку плавательного пузыря снимают. Паразиты, находящиеся в его стенке и поло­стях, обычно хорошо видны. Их извлекают и исследуют. Иногда берут соскоб с внутренней оболочки пузыря больной рыбы и тщательно микроско­пируют.

Мочевой пузырь. Методика исследования сходна с исследованием желчного пузыря. В мочевом пузыре обнаруживают сосальщиков, спорови­ков и инфузорий.

Половые железы. Для обнаружения паразитов железу частями компрессируют между двумя стеклами и просматривают под микроскопом. В половых железах встречаются микроспородии и крупные плероцеркоиды, окруженные фиброматозными сумками.

Желудочно-кишечный тракт. Пищевод, желудок и кишечник извлекают, освобождают от жира, расправляют и вскрывают, начиная с пище­вода. Обнаруженных крупных паразитов (ленточных и круглых червей, сосальщиков) помещают в физиологический раствор. Содержимое из различ­ных отделов желудочно-кишечного тракта исследуют компрессорным методом под микроскопом. Затем с помощью скальпеля делают глубокий соскоб со слизистой оболочки из нескольких мест и исследуют на наличие микроскопи­ческих паразитов.

Мышцы. Для обнаружения зараженности рыб плероцеркоидами, лентецами и другими крупными паразитами мышцы разрезают на пластинки толщиной 5 мм и просматривают. Чтобы найти мелких паразитов, берут не­большие кусочки мышц из различных частей тела и исследуют компрессор­ным методом под лупой и под малым увеличением микроскопа.

Головной и спинной мозг исследуют компрессорным мето­дом. В этих органах можно обнаружить споровиков Myxosoma cerebralis, Tetrocotyle variegateu.

Хрящи. Для обнаружения возбудителя миксозомоза (вертежа лососе­вых) компрессорным методом исследуют черепные и межпозвоночные хрящи.

Мазки крови окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Готовую краску Романовского перед окрашиванием разводят нейтральной дистиллированной водой из расчета 2-3 капли краски на 1 мл воды. Раствор метиленовой сини перед употреблением разводят дистиллирован­ной водой 1 : 10 и окрашивают мазки 30 с, затем промывают водой и диф­ференцируют в течение нескольких секунд 5-10 %-ным раствором танина. Эритроциты окрашиваются в красновато-фиолетовый цвет, плазма простей­ших кровепаразитов – в ярко-голубой, ядра лейкоцитов – в фиолетовый.

Для изучения морфологии паразитических инфузорий их окрашивают железным гематоксилином по Гейденгайну, а также гематоксилином Делафильда или квасцовым кармином.

Паразитических жгутиконосцев окрашивают железным гематоксилином или по Романовскому-Гимзе.

Слизистых споровиков окрашивают 1 %-ным водным раствором метиленового синего 30-60 мин, затем препарат промывают в воде, последова­тельно проводят через спирты возрастающей крепости (70, 80, 96 %-ный и абсолютный) и просветляют ксилолом.

Трематод и цестод окрашивают квасцовым кармином. Фиксированные в спирте препараты промывают в течение нескольких часов в проточной или часто сменяемой воде и помещают в краску от одной минуты до несколь­ких часов (в зависимости от толщины гельминта). Продолжительность окрас­ки можно контролировать микроскопией препаратов. Окрашенные препараты переносят в дистиллированную воду, где в течение нескольких минут их тщательно отмывают от краски. Отмытых паразитов осторожно сушат филь­тровальной бумагой и проводят через спирты возрастающей крепости (70, 80, 96 %-ный), выдерживая в них несколько часов. Обезвоженных парази­тов просветляют маслом и ксилолом.

Мелких цестод можно окрашивать молочнокислым кармином по Блажину. Молочную кислоту разводят в 2 раза дистиллированной водой, добав­ляют небольшое количество кармина (в зависимости от желаемой степени окраски). Жидкость кипятят. Красить лучше свежие, нефиксированные объек­ты. Продолжительность окраски контролируют под микроскопом, а в случае перекрашивания объект переносят в цельную молочную кислоту для обесцвечивания. Окрашенный препарат промывают 20-60 мин водопроводной во­дой и помещают в бальзам.

При окраске крупных цестод этот способ модифицировали. Цестод промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде при ком­натной температуре летом один день, в холодное время года – 3-4 дня. Затем их помещают на 4-6 ч в краску (0,3 г кармина на 100 мл 30 %-ной молочной кислоты). Интенсивность прокрашивания контролируют под мик­роскопом. После этого на сутки их переносят в дистиллированную воду, в которую добавляют 3 капли раствора сернокислого железа и 2 капли 1 %-ного раствора фенола. Далее цестод переносят на чистое предметное стекло, расправляют и высушивают при температуре 30-37 °С. Высохший очень плотно приставший к стеклу препарат заливают канадским бальзамом или канифолью, растворенной в смеси, состоящей из равных частей хлоро­форма и абсолютного спирта.

Для приготовления временных препаратов нематод не окрашивают, а кладут для просветления в неразведенную молочную кислоту или лакто-фенольный раствор (2 части глицерина, 1 часть молочной кислоты, 1 часть фенола и 1 часть воды) на 3-10 дней. Мелких гельминтов на 1-2 дня помещают в молочную кислоту (1-2 капли) и накрывают покровным стеклом.

Постоянные препараты для микроскопического исследования нематод готовят так. Фиксированных в 70 %-ном спирте живых гельминтов через сутки помещают на несколько часов (в зависимости от величины нематод) в 96 %-ный, а затем в абсолютный спирт на 3-5 мин. После этого их пере­носят в гвоздичное или хеноподиевое масло или карбоксилол на 2-5 мин, а затем кладут на чистое предметное стекло и заливают бальзамом.

Скребней (акантоцефалов) для изучения хоботка и крючков просветляют. Для этого их из 70 %-ного спирта переносят сначала в 50 %-ный глицерин, а затем в чистый. Структуру других органов изучают после полного обез­воживания гельминтов путем постепенного проведения их через спирты воз­растающей крепости. Из абсолютного спирта гельминтов переносят на пред­метное стекло в каплю кедрового масла, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Паразитических рачков исследуют в той же жидкости, в которой хра­нят. Красить их не обязательно. Иногда прибегают к окраске борным кар­мином, эозином, сафранином и др.

Идентификацию паразитов проводят по «Определителю паразитов прес­новодных рыб СССР» (Изд-во АН СССР, 1984-1985 гг., Т. 1-3).

Контрольные вопросы.

1 Какие болезни рыб называют инвазионными и как их классифицируют?

2 В чем сущность полного паразитологического вскрытия рыбы?

3 Какое количество рыб обследуют для выяснения паразитологнческой си-
туации в хозяйстве?

4 Как учитывают количество найденных паразитов?

5 В каком порядке проводят внешнее обследование рыбы?

6 Как берут кровь и фиксируют мазок?

7 Что такое компрессионный метод исследования?

8 В какой последовательности исследуют внутренние органы?

9 Как исследуют кишечник, почки и печень?

10 Как обследуют глаза и каких паразитов там часто находят?

11 Как обнаруживают возбудителя вертежа лососевых?

12 Какие паразиты локализуются в плавательном пузыре и как их обна-
руживают?