Вирусологическое исследование (4 часа)

Содержание. Отработка приемов взятия и обработки патологического ма­териала.

Материальное обеспечение. Рыба с клиническими признаками вирусного забо­левания, раствор Хенкса или Эрла, растворы пенициллина и стрептомицина, спирт этиловый, пробирки со стерильным МПБ, чашки Петри с МПА, столик для вскрытия рыбы, стерилизатор со стерильными инструментами (ножницами, анатомическими и хирургическими пинцетами), скальпель, стерильная фарфоро­вая ступка с пестиком, стерильный кварцевый песок, спиртовки или газовые го­релки, стерильная посуда (пипетки, центрифужные пробирки, флаконы для пато- логического материала), стерильный фильтровальный аппарат с мембранным фильтром с диаметром пор 0,45 мкм, вата, резиновая груша со шлангом, ваку­умный насос (электрический или водоструйный), рефрижераторная центрифуга, термостат.

Организация и проведение работы. Патологический материал для вирусологических исследований берут от живых или только что погибших рыб с выраженными клиническими признаками за­болевания в его начальной стадии или в разгаре. При сборе па­тологического материала необходимо учитывать способность виру­са размножаться и накапливаться в тех или иных органах и тка­нях рыбы (тропизм вируса) и отбирать в первую очередь те органы и ткани, в которых вирус накапливается в наибольших ко­личествах. При заболеваниях невыясненной этиологии исследуют в основном наиболее пораженные органы и ткани. Рыбу младших возрастных групп берут в количестве 30–40 шт. из одного пруда, объединяя по 10 шт. в одну пробу. Рыбу старших возрастных групп берут по 5-10 шт. из пруда, объединяя по 5 рыб в пробу.

Отбор патологического материала и последующую его обработ­ку проводят в асептических условиях. Патологический материал, используемый для проведения вирусологических исследований, ос­вобождают от бактериальной и другой микрофлоры.

Основными методами, используемыми в диагностике вирусных болезней, являются культивирование и идентификация вирусов.

Для доказательства вирусной этиологии болезни необходимо: выделение вируса из организма больной рыбы, пассирование его на культуре клеток или чувствительных рыбах, воспроизведение болезни у здоровых рыб того же или родственного вида, повторное выделение того же вируса от экспери­ментальных животных.

Для идентификации вирусов используют несколько взаимодополняющих методов: электронная микроскопия вируса, изучение его физико-химических свойств, обнаружение характерных морфологических изменений в зараженных клетках и симптомов у зараженных животных, различные иммунологи­ческие методы.

Вирусы выделяют в основном на однослойных первичных или переви­ваемых клеточных культурах, подбирая в каждом случае культуры, чувстви­тельные к данному вирусу. Для получения первичных культур клеток рыб наиболее часто используют гонады самок карпа или карася. Гонады должны быть II или II-III стадии зрелости по шкале Киселевича. Такие гонады не содержат икринок, различимых невооруженным глазом. В противном случае содержимое икринок будет отрицательно влиять на рост клеток. Культуры клеток из гонад карпа и карася готовят по утвержденной методике.

В качестве перевиваемых культур наиболее широко используют следую­щие клеточные линии: FHM – из тканей хвостового стебля жирноголового гольяна; RTG – из гонад радужной форели; ЕРС – из оспенных разростов на коже карпа. Названные линии поддерживаются в специализированных лабораториях по изучению болезней рыб ветеринарных и рыбохозяиственных научно-исследовательских институтов, где их можно заказать и получить.

При диагностике хорошо изученных вирусных болезней исследуют органы и ткани, где концентрируется возбудитель.

При болезнях рыб, сведения о которых недостаточны, вирусологическому исследованию подвергают наиболее пораженные органы. Соскобы с кожи и жабр, кусочки этих органов вместе со слизью помещают в стерильные фла­коны с 2–3 мл стерильного физиологического или буферного раствора. Пробы из внутренних органов берут в строго асептических условиях.

В тех случаях, когда быстро исследовать материал невозможно, его сохраняют не более суток в холодильнике при температуре не выше 5 °С. Материал в замороженном состоянии можно сохранять более длительное время.

Предназначенный для исследования патологический материал измель­чают в гомогенизаторе или растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком. Из измельченных тканей готовят 10 %-ную суспензию на растворах Хенкса, Эрла, буферном или физиологическом растворе и центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин, надосадочную жидкость отсасывают пипеткой и помещают в стерильные флаконы. Если суспензия не стерильна, подготовленные материалы фильтруют через мембранные фильтры с диамет­ром пор 0,2-0,45 мкм или обрабатывают антибиотиками (пенициллин 1000 ЕД/мл и стрептомицин 1000 мкг/мл).

Из кишечного содержимого готовят 20 %-ную взвесь в стерильной дистиллированной воде и центрифугируют 10-15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 4000-5000 об/мин в течение 30 мин. Затем ее отсасывают в стерильный флакон и обрабатывают антибиотиками. На 1 мл добавляют 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 ЕД/мл пенициллина. Смесь выдерживают 2-3 ч при комнатной температуре. Все материалы проверяют на бактериальную сте­рильность путем посева на мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). Приготовленные материалы сразу используют для работы или, в крайнем случае, сохраняют в замороженном состоянии (при температуре минус 20 °С).

Заражение культуры клеток.Для заражения используют пробирки с хорошим клеточным монослоем или зоной роста вокруг эксплантата. Питательную среду отсасывают и в каждую пробирку вносят по 0,2-0,3 мл исследуемой суспензии. Одновременно в пробирки добавляют по 0,8-0,9 мл питательной среды с 2-3 % сыворотки.

Материалом, приготовленным из каждой пробы, заражают культуру тканей в 4-6 пробирках. Из каждой серии исследований столько же про­бирок оставляют в качестве контроля, добавляя в них по 1 мл питательной среды. Пробирки оставляют при комнатной температуре на 1-2 ч для ад­сорбции вируса на клетках, затем отсасывают пипеткой надосадочную жид­кость и вносят поддерживающую питательную среду до первоначального объема.

Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при темпера­туре 22-26 °С и ежедневно просматривают под малым увеличением микро­скопа для обнаружения появившихся морфологических изменений в клетках. При выраженной дегенерации клеток культуральную жидкость отсасывают и делают пассажи, а при отсутствии цитопатогенного действия (ЦПД) про­водят два последовательных пассажа. Для этого используют культуральную жидкость вместе с клеточной фракцией, разрушенной путем повторного за­мораживания и оттаивания. Для заражения свежих культур используют надосадочную жидкость центрифугированной клеточной массы. ЦПД после третьего пассажа учитывают как специфическое действие вирусного агента.

Степень поражения клеточного монослоя оценивается по 4-крестовой системе; «+» – поражение до 25 %, «+ +» – до 50 %, «+ + +» – до 75 % и

«+ + + +» – до 100 % монослоя.

При некоторых вирусных заболеваниях рыб в клетках (цитоплазме и ядре) различных органов и тканей появляются тельца-включения.

Материалом для исследования вирусных включений служат инфициро­ванные культуры тканей, соскобы и мазки-отпечатки из органов и тканей. Указанные материалы перед окраской фиксируют по общепринятым методам, используя жидкости Дюбоск-Бразил-Буэна, Буэна, Карнуа или 10 %-ный раствор нейтрального формалина.

Вирусные включения окрашивают различными методами: по Муромцеву, Трубиной, Манну, Селлексу, Клисенко, Романовскому-Гимзе, Май-Грюнвальду -Гимзе и др.

Титрование вируса – количественное определение вирусной активности. Титр вируса выражается количеством инфекционных единиц, содержащихся в единице объема суспензии вируса. За инфекционную единицу вируса при­нимается такая его доза, которая вызывает инфекцию у 50 % зараженных ею чувствительных объектов. Такая доза вируса называется инфекционной и обозначается ИД_50.

В качестве чувствительных объектов при титровании вирусов рыб ис­пользуют главным образом культуры клеток. Титрование на культуре кле­ток осуществляют по цитопатогенному действию вирусов. В этом случае ИД₅₀ называют тканевой цитопатогенной дозой (ТЦД₅₀), а титр вируса выражают количеством ТЦД₅₀ в 1 мл вирусной суспензии. Титр вируса при этом определяют методом конечных разведений.Согласно этому методу в чувствительные культуры клеток вводят определенный объем суспензии вируса в последовательно возрастающих разведениях и, учитывая результат каждого введения как положительный (если есть ЦПД) или отрицательный (если ЦПД отсутствует), рассчитывают конечную точку титрования – 1 ТЦД₅₀.

Для титрования вирусов, дающих ярко выраженное ЦПД, используют также метод бляшек.При этом зараженный вирусом монослой клеток зали­вают смесью питательной среды с агаром, чтобы предотвратить перенос вируса на другие клетки, значительно удаленные от первично инфицирован­ных, и иметь возможность инфицировать первоначальные очаги заражения (бляшки).

Каждая бляшка возникает из одной инфекционной единицы, которую обозначают БОЕ (бляшкообразующая единица), а титр вируса выражают количеством БОЕ в единице объема суспензии.

Реакция нейтрализации (РН) на культуре клеток. В основе реакции лежит связывание антигена антителами гомологичной антисыворотки. Реакцию используют для идентификации возбудителей при диаг­ностике заболеваний вирусной этиологии. Она позволяет определять по из­вестным антителам неизвестный вирусный антиген или по заведомо извест­ному (стандартному) антигену – неизвестные антитела в сыворотках больных или переболевших рыб.

Определение выделенного вируса в реакции нейтрализации проводят, применяя набор диагностических гипериммунных антисывороток (антител) и гомологичных к ним антигенов (вирусов).

Гипериммунные антисыворотки получают при заражении лабораторных животных (например, кроликов) известными штаммами вирусов – возбуди­телей болезней рыб. У полученных антисывороток определяют титры специ­фических антител. Для работы берут антисыворотки, содержащие антитела в высоких титрах.