Задача 2. Определение временных и амплитудных параметров вызванных ПКП в норме и под действием физиологически активных веществ
Тема 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОСТСИНАПТИЧЕСКИХ ПОТЕНЦИАЛОВ
Введение
Высокоспециализированные функциональные контакты, существующие между нейроном и другими клетками (нервными, мышечными, железистыми), получили название синапсов. Исследования химической синаптической передачи были начаты в 20-30-е гг. XX в., в работах отечественных и зарубежных физиологов – А.Ф.Самойлова, Х.С.Коштоянца, А.В.Кибякова, О.Леви, Г.Дейла, В.Фельдберга, Дж.Экклса, и др.. Механизмы функционирования синапсов продолжают активно изучаться и в настоящее время. Классическими объектами для исследования химических синапсов являются нервно-мышечные соединения скелетных мышц позвоночных – концевые пластинки.
Миелинизированный аксон мотонейрона, вступая в контакт со скелетным мышечным волокном, постепенно утоньшается и теряет свою миелиновую оболочку. Поблизости от места формирования синаптического контакта аксон образует на поверхности волокна конечные разветвления, которые называются пресинаптическими нервными окончаниями или нервными терминалями.
Мембрана мышечного волокна, находящаяся непосредственно под нервными терминалями, называется постсинаптической. У скелетных мышечных волокон высших позвоночных постсинаптическая мембрана и прилежащая к ней саркоплазма заметно выступают над общей поверхностью волокна, образуя как бы небольшой вырост, который назвали "подошвой", или "платформой" для контакта с нервным волокном, откуда и берет название этот тип синапсов - "концевая пластинка" (end platte). Постсинаптическая мембрана мышечного волокна имеет множество складок, расположенных непосредственно под пресинаптическими нервными окончаниями. В аксоплазме нервных терминалей с помощью электронной микроскопии обнаружено большое скопление характерных пузырьков - везикул. Медиатор нервно-мышечных синапсов – ацетилхолин (АХ) – содержится как в самой аксоплазме терминалей, так и в синаптических пузырьках. Однако его концентрация в пузырьках в 25-30 раз выше. Согласно классическим представлениям, под воздействием нервного импульса, распространяющегося от тела нейрона до его нервных терминалей, происходит деполяризация мембраны нервной терминали и высвобождение медиатора из везикул в синаптическую щель путем экзоцитоза.
Потенциал действия распространяется по аксону вплоть до последнего миелинизированного сегмента с постоянной амплитудой и скоростью. В области конечных разветвлений аксона амплитуда и скорость ПД могут снижаться в связи с тем, что здесь аксон утоньшается и разветвляется, и это замедляет распространение ПД. Деполяризация мембраны нервной терминали приводит к открыванию потенциал-активируемых натриевых, калиевых и кальциевых каналов на ее мембране. Кальциевые каналы сосредоточены в непосредственной близости к месту скопления пузырьков в примембранном пространстве нервной терминали, в так называемых “активных зонах”.
Часть везикул с помощью сложного комплекса специальных белков-сцепок – синаптотагмина, синаптобревина, синаптофизина и других – прикреплена к мембране терминали вблизи от кальциевых каналов и готова к экзоцитозу – высвобождению медиатора. Момент слияния везикулы с мембраной терминалии и выброс из нее медиатора происходит лишь в ответ на генерацию на мембране пресинаптического ПД, который приводит к открыванию потенцил-активируемых Са-каналов терминали и входу по ним ионов кальция. Это приводит к кратковременному повышению концентрации свободного ионизированного кальция вблизи примембранных синаптических пузырьков. Это, в свою очередь, ведет к слиянию везикул с пресинаптической мембраной и высвобождению из них ацетилхолина в синаптическую щель.
Молекулы ацетилхолина пересекают синаптическую щель и взаимодействуют с холинорецепторами, встроенными в постсинаптическую мембрану мышечного волокна. В результате этого взаимодействия изменяется конформация молекулы холинорецептора, являющейся одновременно канальным белком, и это приводит к открыванию ионного канала в молекуле холинорецептора. Ионный канал холинорецептора обладает относительно низкой ионоселективностью и проницаем и для ионов натрия, и для ионов калия, и отчасти – для ионов кальция, однако проницаемость для ионов натрия в 1,5-2 раза выше, чем для ионов калия, поэтому преимущественный ионный ток создают ионы натрия. Вход ионов натрия по каналам холинорецепторов приводит к кратковременной деполяризации постсинаптической мембраны, называемой постсинаптическим потенциалом, или потенциалом концевой пластинки (ПКП).
Электрофизиологический анализ амплитудно-временных параметров постсинаптических потенциалов привел исследователей к заключению, что молекулы ацетилхолина поступают в синаптическую щель не путем непрерывной диффузии, а дискретными порциями, или "квантами". Носителями таких порций-“квантов” АХ являются синаптические везикулы. Ах попадает в везикулу из аксоплазмы, где он синтезируется, с помощью специальной молекулы-транспортера, встроенной в мембрану везикулы. В результате в везикуле накапливается определенное количество медиатора, которое высвобождается в сианптическую щель при экзоцитозе везикулы и носит название «кванта» медиатора.
Установлено, один квант медиатора содержит около 10 000 молекул АХ. При высвобождении такой порции медиатора в синаптическую щель молекулы АХ диффундируют к постсинаптической мембране и взаимодействуют с молекулами холинорецепторов, расположенных на постсинаптической мембране. Электрофизиологические и авторадиографические исследования показали, что в результате высвобождения одного кванта АХ на постсинаптической мембране открывается 2000-2500 ионных каналов холинорецепторов, расположенных на площади порядка 2мкм2. Возникает входящий ионный ток и происходит кратковременная деполяризация постсинаптической мембраны; эти процессы можно наблюдать при внутриклеточном отведении потенциалов в виде отдельного миниатюрного потенциала концевой пластинки – минПКП. Итак, электрофизиологическим проявлением секреции АХ в виде "квантов" являются миниатюрные потенциалы концевой пластинки (минПКП). Они были зарегистрированы впервые в 1952 г. П.Фэттом и Б.Катцем в концевой пластинке портняжной мышцы лягушки. МинПКП возникали спонтанно, без внешних воздействий на нервное волокно; их амплитуда колебалась от 0,1 до 1,0мВ.
Случайный нерегулярный выброс отдельных квантов медиатора может происходить спонтанно, в отсутствии нервного импульса. Величины минПКП, регистрируемых в одном нервно-мышечном синапсе, примерно одинаковы и, несмотря на некоторые вариации амплитуд минПКП,их амплитудное распределение обычно соответствует нормальному гауссовому распределению. Этот факт свидетельствует об относительном постоянстве размеров квантов медиатора.
Временные параметры минПКП. На рис. видно, что отдельный ПКП достигает максимума в течение 1-1,5мс, а его спад носит экспоненциальный характер с постоянной времени 4-6мс. В случае генерации минПКП ионный ток, входящий через каналы холинорецепторов и текущий через Rсин (сопротивление каналов холинорецепторов для входящего синаптического тока) и Cм (емкость мембраны постсинаптической клетки) быстро перезаряжает (деполяризует) ее, а уже через 1-1,2мс каналы холинорецепторов закрываются, и ток прекращается. Поэтому период нарастания минПКП – это время, в течение которого входящий синаптический ток (минТКП) течет через rсин и Cм мембраны, а спад потенциала (минПКП) – функция постоянной времени мембраны (то есть отражает временной ход разрядки емкости мембраны Cм через пассивное сопротивление постсинаптической мембраны Rм). Таким образом, постоянная спада минПКП зависит от tм=Rм.Cм (рис. 5.).
А. Б.
Рис. 5. А. Сравнение тока концевой пластинки (ТКП), зарегистрированного методом фиксации потенциала, и потенциала концевой пластинки (ПКП), зарегистрированного внутриклеточным микроэлектродом.
Б. Эквивалентная электрическая схема постсинаптической мембраны;
См - емкость постсинаптической мембраны,
Rм - пассивное сопротивление постсинаптической мембраны,
Rсин - сопротивление каналов холинорецепторов для входящего синаптического тока,
Eм - мембранный потенциал покоя, Ес - равновесный потенциал для входящего синаптического ионного тока.
Средняя амплитуда минПКП, регистрируемых в мышечном волокне диафрагмы мыши – порядка 1,0мВ. Амплитуда минПКП зависит (помимо размеров самого кванта медиатора) от уровня мембранного потенциала мышечного волокна, от сопротивления постсинаптической мембраны, а также от активности ацетилхолинэстеразыв синаптической щели.
Частота минПКП, т.е. число квантов, высвобождаемых в единицу времени из нервного окончания, – функция состояния пресинаптической нервной терминали. В отличие от амплитуды минПКП, их частота не зависит от состояния постсинаптической мембраны. Экспериментально установлено, что при деполяризации нервной терминали электрическим полем или под действием растворов с повышенным содержанием ионов калия частота минПКП увеличивается. При гиперполяризации терминали частота минПКП, напротив, снижается. В мышечных волокнах диафрагмы мыши частота регистрируемых минПКП, в среднем – около 1Гц.
Потенциалы концевой пластинки (ПКП), вызванные нервным импульсом. Как говорилось выше, высвобождение медиатора может происходить как спонтанно, так и под действием нервного импульса, приходящего к нервной терминали. Деполяризация нервной терминали вследствие генерации пресинаптического ПД на мембране, приводит к открыванию потенциал-зависимых Са2+-каналов на мембране терминали. Входящий по этим каналам кальций связывается с белками, встроенными в мембрану везикулы, что приводит к слиянию везикулы с мембраной терминали и экзоцитозу содержимого везикулы в синаптическую щель. В ответ на 1 пресинаптический ПД может одновременно подвергаться экзоцитозу от десятка до сотен везикул. Высвобождающийся из множества везикул медиатор действует на постсинаптическую мембрану и вызывает генерацию высокоамплитудного постсинаптического потенциала, называемого потенциалом концевой пластинки (ПКП). ПКП, возникающий в ответ на нервный импульс, является результатом одновременного действия на постсинаптическую мембрану 50-200 квантов медиатора. Амплитуда ПКП может колебаться от импульса к импульсу и достигать величин 20-50мВ. Колебания амплитуды ПКП связаны с тем, что число везикул, готовых к экзоцитозу в каждый данный момент времени в ответ на действие на них ионов кальция, непостоянно.
Число квантов, высвобождаемых из терминали в ответ на нервный импульс, можно ограничить путем уменьшения концентрации ионов кальция и повышения концентрации ионов магния в наружной среде. При этом становится хорошо заметно, что флуктуации амплитуды ПКП всегда кратны величине одного кванта медиатора. Можно подсчитать квантовый состав (m) одного ПКП путем деления средней амплитуды ПКП на среднюю амплитуду минПКП: 
Таким образом, эффективность синаптической передачи регулируется путем изменения числа выделяемых квантов медиатора. Изучение эффектов одиночных квантов медиатора (регистрируемых в виде минПКП) и эффектов, вызываемых одновременным высвобождением многих квантов АХ (регистрируемых в виде ПКП), обеспечивает возможность детального анализа пре- и постсинаптических механизмов функционирования химического синапса.
Влияние ингибиторов ацетпилхолинэстеразы. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) – фермент, расщепляющий молекулы АХ на холин и уксусную кислоту. Молекулы АХЭ находятся в синаптическй щели: они встроены в базальную мембрану, покрывающую постсинаптическую мембрану. Особый интерес представляет действие ингибиторов АХЭ (армина, прозерина и др.). Ингибиторы резко увеличивают продолжительность действия ацетилхолина, выделяемого из нервных окончаний. При этом возрастает длительность синаптических потенциалов и их амплитуда. Эксперименты показали, что несмотря на присутствие в синаптической щели АХЭ все кванты АХ (хотя и в редуцированном виде) достигают постсинаптической мембраны. Назначение АХЭ сводится лишь к тому, чтобы ограничить время пребывания медиатора в синаптической щели вблизи холинорецепторов. В нормальных условиях ацетилхолинэстераза, быстро гидролизуя молекулы АХ, укорачивает время присутствия медиатора в щели, а также обеспечивает быстрое и независимое действие отдельных квантов АХ, ограничивая зону распространения молекул ацетилхолина, входящих в один квант.
В условиях инактивации АХЭ с помощью ингибиторов появляется возможность повторных связываний негидролизованных молекул ацетилхолина с рецепторами постсинаптической мембраны. Происходит, по-видимому, частичное перекрытие зон действия отдельных квантов медиатора, в результате повторные взаимодействия АХ с ХР продлевают временной ход синаптического тока, увеличивая время нарастания и спада минПКП.
Задача 1. Определение временных и амплитудных параметров минПКП волокон диафрагмальной мышцы мыши в норме и под действием физиологически активных веществ.
Цель задачи. Зарегистрировать минПКП и исследовать их частоту, временные параметры и амплитудное распределение. Проследить за изменением параметров минПКП под действием исследуемого вещества.
Методика
Материалы и оборудование
Приборы. Микроманипулятор, камерка с препаратом и стереомикроскоп МС-2-ZOOM (с подсветкой снизу), волоконный осветитель – расположены внутри экранирующей камеры. Стимулятор ЭСЛ-2, усилитель Nihon Kohden Micro-electrode Amplifer с блоком питания, постусилитель, осциллограф С1-18 для регистрации мембранного потенциала, аналогоцифровой преобразователь (АЦП) и компьютер для регистрации сигналов – расположены вне экранирующей камеры.
Электроды. Для регистрации минПКП используют хлорсеребряные электроды (отводящий и индифферентный) – тонкие (диаметром 0,4-0,6мм) серебряные проволоки, хлорируемые перед началом работы. Микроэдектрод, заполненный 2,5М раствором КС1 (кончик его ополоснуть дистиллированной водой), укрепить с помощью специального держателя на препаратоводителе и расположить его над мышцей. Препаратоводитель в свою очередь укреплен на площадке микроманипулятора, при вращении винта которого микроэлектрод перемещают в вертикальной плоскости. Отводящий хлорсеребряный электрод вставить в уже закрепленный микроэлектрод. В камерку с препаратом опустить индифферентный электрод, соединенный с землей усилителя.
Состав физиологического раствора Лайли (в мМ):
NaCl – 135, КС1 - 4, NaH2PO4 - 0,9 мM, MgCl2 – 1 мМ, CaCl2 – 2 мM, NaНСО3 - 16,3 мM, Глюкоза – 11 мM.
Приготовление раствора Лайли
Для приготовления 1000 мл маточного раствора, в котором концентрации солей в 20 раз больше, чем в нормальном растворе Лайли, берут следующие количества солей:
| NaCl - | 157,6г | NaH2P04.H20 - | 2,8г |
| КСl - | 6г | MgCl2.6H20 - | 4г |
Перед экспериментом приготовить 1000 мл раствора Лайли (раствор можно использовать не более 2-х дней, при условии его хранения в холодильнике). В мерный стакан налить 800 мл дистиллированной Н20 и добавить (в заданном порядке) – 50 мл маточного раствора, NaHC03 - 1,35 г, глюкозу - 5 мл 40%-го раствора из ампулы или 2г сухого вещества, CaCI2 -2,2 мл 10%-го раствора из ампулы или 2 мл 1М раствора. Затем добавить дистиллированной воду до метки 1000 мл. Пропустить через раствор карбоген (96% - О2, 4% - CO2). Измерить рН раствора, который должен быть 7,2-7,4.
Препаровка. Приготовить изолированный препарат левой половины диафрагмы и подходящего к ней диафрагмального нерва. Декапитированную мышь расположить брюшной стороной вверх (левая половина диафрагмы лежит справа от работающего), кожу и мышцы разрезать посередине грудной клетки и отвести в разные стороны. Затем сделать продольный разрез грудной клетки, начиная от мечевидного отростка грудины и далее вверх вдоль по линии грудины. Второй поперечный разрез, по дуге между V-м и VI-м ребрами, выше линии прикрепления диафрагмы. При этом надо стараться все время видеть кончики ножниц так, чтобы не отрезать диафрагму от нижележащих ребер, к которым она крепится. Выше разреза удаляют все ребра. Виден левый диафрагмальный нерв, идущий по средостению и входящий в диафрагму. Осторожно сдвигают нерв к середине, а доли левого легкого вправо. Промыть грудную клетку раствором Лайли и осторожно отпрепаровывают диафрагмальный нерв от тканей средостения, начиная от диафрагмы и следуя вверх по направлению к шее. Отпрепарованный участок нерва длиной 1,5-2см, перерезают. Чтобы окончательно вырезать диафрагму, нужно сделать третий разрез – тоже поперечный, по дуге ниже уровня прикрепления диафрагмы, а затем – четвертый, последний – через саму диафрагму по медиальной линии, разделяющей диафрагму на правую и левую половины.
Изолированный нервно-мышечный препарат фиксируют на специальной подложке энтомологическими булавками, слегка растягивая мышцу до ее нормальных размеров. Подложку с препаратом помещают в камерку и заполняют ее раствором Лайли. Камерку с препаратом помещают в экранирующую камеру.
Ход работы
Включить освещение камерки с лежащим в ней препаратом (подсветка снизу) и сфокусировать бинокулярный микроскоп на поверхность мышцы для отыскания синаптических зон. Поиск ведется при увеличении: объектив ´2, ´4; окуляр ´8. Под контролем бинокуляра движением винта микроманипулятора опускать микроэлектрод в камерку до тех пор, пока не станет видно, что он вошел в раствор, но еще не касается мышцы. Порядок включения приборов: сначала – компьютер, а затем – первый усилитель биопотенциалов (Nihon Kohden) и второй (самодельный) усилитель, а также - осциллограф. Необходимо вывести луч на экран осциллографа С1-18. Для этого нужно воспользоваться ручкой «Усилитель YII», плавно. На экране осциллографа должен появиться луч. Усилитель Nihon Kohden Micro-electrode Amplifer переключить на режим калибровки CAL. и установить нужную величину калибровочного импульса (10 или 20 мВ). Далее на осциллографе С1-18 плавно отрегулировать полосу пропускания (MHz) так, чтобы амплитуда калибровочного сигнала составила 1 клетку. Для записи минПКП на усилителе Nihon Kohden Micro-electrode Amplifer установить величину калибровочного сигнала 1 мВ, а для записи ПКП – 20 мВ. На втором усилителе с помощью ручек «Усиление» и «Уст.0» добиться того, чтобы калибровочный сигнал целиком был виден на экране компьютера и составлял пример четверть от размера экрана. Далее переключить усилитель Nihon Kohden Micro-electrode Amplifer в режим работы EXT.
Сначала необходимо приобрести навык введения микроэлектрода в мышечное волокно с помощью микроманипулятора. Микроэлектрод подводят к поверхности клетки осторожными и очень малыми поворотами микровинта. При этом внимательно наблюдают за лучом осциллографа С1-18. Резкий скачок луча вниз указывает на попадание микроэлектрода в волокно. Если микроэлектрод хорошо введен в волокно и оно не повреждено, то значения мембранного потенциала порядка - 70-80мВ. Для поиска синаптических зон важно подобрать оптимальный контраст освещенности (с помощью зеркала под камеркой с препаратом). Синаптические зоны у диафрагмальной мышцы располагаются по ходу хорошо видных веточек нерва. В зависимости от контрастности освещения нерв и его конечные разветвления могут быть белого или темного цвета. На рис.6. схематически изображены препарат и расположение синапсов.
|
Рис. 6. Схема нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши и входящего в нее диафрагмального нерва. Точками указаны вероятные места расположения синаптических контактов.
При попадании электродом в синаптическую зону на экране компьютера появляются минПКП. Амплитуда МПКП в среднем должна быть около 0,8-1 мВ. О близости введенного электрода к синапсу можно судить по короткому времени нарастания потенциала. Убедившись, что видны минПКП, близкие по амплитудно-временным параметрам к среднестатистическим для данного объекта, то есть имеющее время нарастания около 1-1,5 мс и амплитуду 0,5-1мВ, – переходите к их регистрации. Смену физиологического раствора в экспериментальной камере проводить не реже, чем раз в 10-15 минут!
Регистрация минПКП. Для анализа амплитудного распределения минПКП в каждом синапсе необходимо зарегистрировать 80-100 минПКП при непрерывной записи (рис.7). Для этого в программе PowerGraph надо нажать кнопку «Старт», вести запись в течении 3 минут, в конце регистрации записать калибровочный сигнал (1 мВ), далее остановить запись кнопкой «Стоп». Сохранить полученный блок отдельным файлом. Необходимо отмечать в тетради уровень мембранного потенциала в каждом синапсе, при котором велась регистрация минПКП.
Рис. 7. Вид минПКП при регистрации микроэлектродом. Развертка луча монитора -3 мс/см, амлитдуда калибровочного сигнала - 1мВ.
Анализ воздействия вещества Х на минПКП. Зарегистрировать минПКП от 3-5 синапсов в нормальном растворе Лайли. Затем заменить нормальный (контрольный) раствор Лайли на опытный, содержащий исследуемое вещещство (исследуемое вещество Х и его концентрация задаются преподавателем, в зависимости от поставленной задачи). Препарат промыть в растворе, содержащем вещество Х, несколько раз. Зарегистрировать минПКП от максимально возможного числа разных синапсов, строго фиксируя для каждой записи время, прошедшее с момента замены нормального раствора Лайли на опытный.
Обработка результатов
Обработка полученных результатов ведется в пограмме MiniAlaysis. Для обработки полученные записи необходимо конвертировать их в формат .abf с помощью ABF Utility (File→Run ABF Utility Program).
Параметры конвертации
Byte location of data block 0
Sampling intaerval (in micro second) 2,5
ADC Voltage Range (Volts) 10
ADC Resolution (12 bit=2048) 8192
Unit (pA of mV) mV
Scaling Factor (Volts/Unit) -подбирается индивидуально
Параметр Scaling Factor (Volts/Unit) подбирается для каждой записи таким образом, чтобы после конвертации амплитуда калибровочного сигнала совпадала с амплитудой, выставленной на усилителе (дли минПКП – 1 мВ, для ПКП – 20 мВ).
В программе MiniAlaysis открыть файл и выставить параметры обсчета сигналов
Threshold (pA) 0
Period to search a local maximum (us) 2500
Time before a peak for baseline (us) 2500
Period to search a decay time (us) 10000
Fraction of a peak to find a decay time 0,5
Period to average a baseline (us) 100
Area threshold (fC) 0
Direction of Peak Positive
Далее следует подобрать параметры развертки, при которых записанные минПКП будут хорошо видны. Развертка по вертикали «Gain», развертка по горизонтали «# Blocks». Навигация внутри файла с записью осуществляется клавишами A (в начало файла), S (назад), D (вперед), F(в конец файла). Далее на записи надо отметить минПКП нажатием на них левой кнопкой мыши. После того, как в файле отмечено 100 минПКП с одного синапса, необходимо сортировать отмеченные минПКП по времени (Events→Sort Events→By time) и сохранить полученный файл. Амплитуды всех отмеченных минПКП в одном файле копируюся в программу Excel, где происходит их дальнейшая обработка.
В программе Excel расчитать среднюю амплитуду минПКП (функция СРЕДНЕЕ (AVERAGE)) и по полученным значениям амплитуд в каждом синапсе построить гистограммы амплитудного распределения минПКП. Построить гистограмму амплитудного распределения минПКП по всем синапсам (cуммарную гистограмму). Для построения гистограммы амплитудного распределения необходимо определить частоту встречаемости амплитуд в синапсе. Для этого в одном столбце выставляются интервалы в которых будут группироваться значения амплитуд минПКП с шагом 0,2 мВ (0; 0,2; 0,4 и т.д.), далее выделается соседний столбец, используется функция ЧАСТОТА (FREQUENCY). В поле Массив Интервалов (Bins_array) выделяется соседний столбец с шагом амплитуд, а в поле Массив Данных (Data_Array) – значения амплитуд минПКП из обсчитанного файла. Далее нажать на строку с функцией и нажать Ctrl+Shift+Enter. По полученным значениям построить гистограммы распределения амплитуд минПКП.
Измерить временные параметры минПКП: время нарастания и время полуспада, а также частоту минПКП. Для этого открыть обсчитанный файл в программе MiniAlaysis. Далее нажать Events→Show Column Statistics→All Events. Из полученной таблицы значения времени нарастания и полуспада и частоты минПКП скопировать в Excel, посчитать средние значения.
Сравнить среднюю частоту, амплитуду, гистограммы амплитудного распределения и временные параметры минПКП до и после действия исследованного вещества.
Задача 2. Определение временных и амплитудных параметров вызванных ПКП в норме и под действием физиологически активных веществ
Цель задачи. Зарегистрировать ПКП в ответ на раздражение диафрагмального нерва, исследовать их временные параметры и амплитудное распределение. Проследить за изменением параметров ПКП под действием исследуемого вещества.