Лабораторная работа № 2.2. Приготовление нервно-мышечного препарата лягушки.

Цель работы. Освоить методику приготовления нервно-мышечного препарата лягушки

Лягушка – традиционный объект физиологических исследований. Международные правила защиты животных предусматривают эксперименты на них с учебной и исследовательской целью, категорически запрещая при этом всякую вивисекцию, т. е. операции на живых, не наркоти­зированных или на необездвиженных и необезболенных объектах. Все опыты на лягушках проводят после наркотизации (эфир) и после­дующего разрушения спинного мозга, в котором проходят про­водящие болевые пути.

Классическим объектом исследования яв­ляется нервно-мышечный препарат, на котором великие физио­логи — Н. Маттеучи, Л. Гальвани, И.М. Сеченов, Н.И. Введен­ский и др. исследовали основные закономерности функционирова­ния живого организма.

Оборудование:препаровальный набор, раствор Рингера для холод­нокровны животных, марля, эфир. Объект исследования - лягушка.

ХОД РАБОТЫ

1. Обездвижьте лягушку. Для этого оберните марлей наркотизиро­ванную эфиром лягушку так, чтобы лапки ее были прижаты к ту­ловищу, а голова оставалась свободной.

Рис. 8.Обездвиживание лягушки (а, б, в).

Большим пальцем накло­ните вперед голову лягушки и найдите углубление, соответствую­щее атланто-окципитальному отверстию, по центру кзади от затылочной кости. Сразу за глазными буграми верти­кально введите в субокципитальное отверстие конец препаро­вальной иглы на глубину 1—2 мм, поверните ее параллельно цен­тральному каналу, введите в него и продвиньте до крестцово-копчикового соединения, круговыми движениями разрушая спинной мозг. Критерием разрушения является полная релаксация (рас­слабление) всех групп мышц лягушки и отсутствие защитных дви­гательных рефлексов на пощипывание кожи и потягивание за лапку. Извлеките иглу из центрального канала и, повернув ее на 180 °, разрушьте головной мозг.

2. Приготовьте нервно-мышечный препарат. Возьмите лягушку за задние лапки, поверните вниз брюшком и, отступив на 1,5 см выше от копчика, перережьте позвоночный столб с окружающими тканями. В руке должны остаться задние лапки с тазовой костью и небольшим отделом позвоночного столба. Захватив край кожи пинцетом, сни­мите ее с лапок. Подведите браншу ножниц под пояснично-крестцовое сочленение и отделите одну лапку ниже так, чтобы со­членение осталось соединенным с фрагментом позвоночного столба. Расположите препарат задней поверхностью вверх. Раз­двинув стеклянным крючком двуглавую и полуперепончатую мышцы, найдите на бедре седалищный нерв. Приподнимите его и на всем протяжении осторожно отделите от окружающих тка­ней. Бедренную кость и мышцы рассеките в двух местах: ниже та­зобедренного и выше коленного суставов. Затем выделите икро­ножную мышцу: отпрепарируйте ее, отрежьте сухожилие от пя­точной кости, а ниже коленного сустава перережьте кости и все мышцы голени. Пяточное сухожилие перевяжите ниткой. В ре­зультате получится нервно-мышечный препарат, который является универсальным для исследования функций скелетных мышц и нервов.

Следует помнить, что при небрежном приготовлении препарата (прикосновение к нерву руками или металлическими предметами, натяжение, подсыхание, механическое повреждение) препарат бы­стро теряет возбудимость. Поэтому во время проведения опыта не­обходимо часто увлажнять нерв и мышцу раствором Рингера.

Рис. 9. Приготовление нервно-мышечного препарата лягушки

Оформление протокола. Зарисуйте основные этапы приготовления нервно-мышечного препарата лягушки.

Опыты Гальвани и Маттеучи

Рис. 10.Опыт Маттеучи

Оборудование и реактивы:стимулятор СИФ-5, набор препаровальных инструментов, стеклянный крючок, стеклянная пластинка, держатели, биметаллический пинцет, 0,65% раствор NaCl. Опыт проводят на двух лягушках

ХОД РАБОТЫ

Первый опыт Гальвани

1. Возьмите нервно-мышечный препарат и набросьте нерв на одну браншу пинцета (биметаллического), а другой браншей касайтесь икроножной мышцы.

Второй опыт Гальвани

2. Ножницами на икроножной мышце сделайте надрез, ближе к коленному суставу. Положите препарат на стеклянную пластинку и на поврежденный участок мышцы стеклянными крючками набросьте нерв так, чтобы его средняя часть касалась поврежденной поверхности мышцы.

Опыт Маттеучи

3. Два препарата укрепите в штативе за бедренную кость в зажиме «крокодил». Укрепите в штативе электроды, соединенные с электронным стимулятором и положите на них нерв одного препарата, а нерв другого препарата расположите вдоль икроножной мышцы первого. Вызывая раздражением нерва, сокращение мышцы первого препарата, наблюдайте за сокращением мышц второго. Объясните возникновение такого действия. Во время работы нужно нерв и мышцу время от времени смачивать рингеровским раствором.

Оформление протокола

1. Опишите полученные результаты.

2. Сделайте выводы.

ВЫВОД:

Опыты Гальвани.При набрасывании нерва на поврежденный участок икроножной мышцы лягушки (нерв контактировал одновременно и с неповрежденным участком) наблюдалось сокращение икроножной мышцы. Это сокращение вызвано токами покоя (потенциалом покоя), возникающим между поврежденным (заряженным отрицательно) и неповрежденным (заряженным положительно) участками икроножной мышцы лягушки.

ВЫВОД:

Опыт Маттеучи.При набрасывании седалищного нерва на электроды стимулятора и подачи прерывистого электрического импульса, наблюдается тетаническое сокращение реоскопической лапки, которое распространяется на второй препарат через нерв, наброшенный на икроножную мышцу первого препарата.

Контрольные вопросы для самостоятельной подготовки

1. Понятие о возбудимости.

2. Изменение возбудимости в процессе возбуждения.

3. Биоэлектрические явления и история их открытия

а) опыты Гальвани;

в) опыт Маттеучи.

Лабораторная работа № 2.4. Одиночное и тетаническое сокращение

Цель работы. Определение порога раздражения мышцы. Получение кривой одиночного сокращения мышцы, а также зубчатого и гладкого тетануса

Оборудование:кимограф, вертикальный миограф, универсальный штатив, электронный стимулятор, набор препаровальных инструментов, раствор Рингера для холоднокровных животных. Объект исследования — нервно-мышечный препарат (икроножная мышца — седалищный нерв лягушки).

ХОД РАБОТЫ

1. Соберите установку для работы с нервно-мышечным препаратом лягушки (рис.11).

Рис. 11.Установка для работы с нервно-мышечным препаратом лягушки.

1— стимулятор УЭС-1; 2 — универсальный штатив; 3 — вертикальный миограф; 4 — мышца лягушки, фиксированная за бедренную кость; 5 — миографический рычажок; 6 — кимограф; 7 — барабан кимографа; 8 — сто­лик-ванночка для размещения нерва с сегментом спинного мозга.

2. Раздражение мышцы прямым и непрямым способами.Приготовленный нервно-мышечный препарат зафиксируйте в вертикальном положении за бедренную кость в штативе. К нижнему концу мышцы прикрепить за длинное плечо рычажок миографа – мышцу расположить над рычагом.

Седалищный нерв расположите горизонтально так, чтобы он контактировал с раздражающими электродами, на­ложите на него тонкий слой ваты, обильно смоченный раствором Рингера. Включите стимулятор. Ручку плавной регулировки силы тока установите в положение "О", а переключатель частоты — в положение "1". Ключ поставьте в положение "Нерв" и, медленно вращая ручку регулировки силы тока, найдите его минимальную силу (порог раздражения), вызывающую минимальное сокращение мышцы. Подведите к ленте кимографа рычажок с писчиком, за­полненный чернилами, и запишите мышечное сокращение при непрямом раздражении мышцы. Затем поставьте ключ в положе­ние "Мышца" и аналогичным способом определите порог возбу­ждения мышцы при ее прямом раздражении. Запись производите на ленте остановленного кимографа, поворачивая барабан рукой после каждой стимуляции.

3. Получение записи одиночного сокращения мышцы.Найти среднюю силу индукционного тока (частота раздражения не должна превышать 1 Гц, длительность 0,5 мс), вызывающего сокращение мышцы (раздражать непосредственно мышцу редкими импульсами – 3 раза в с). Привести писчик в соприкосновение с барабаном кимографа, пустить барабан в ход и быстро замкнув и разомкнув ключ, записать 3-5 сокращений мышцы. Обратить внимание, какой вид имеет кривая одиночного сокращения.

4. Получение зубчатого и гладкого тетануса.Сокращения мышцы записывать на вращающемся барабане. Подряд несколько раз раздражать мышцу, быстро замыкая и размыкая ключ рукой, постепенно наращивая частоту раздражения – 5, 10, 15, 20 Гц (увеличить число раздражающих импульсов до 13-15 в с), чтобы каждое последующее раздражение совпадало с моментом, когда мышца только начала расслабляться от предыдущего раздражения (для этого раздражать ее, когда писчик только-только начнет опускаться вниз). Затем еще больше увеличить частоту раздражений мышцы (увеличить число раздражающих импульсов до 20-30 в с). Для этого или еще чаще замыкать и размыкать ключ рукой, или переключить стимулятор на генерирование прерывистой подачи тока с помощью прерывателя. Раздражения должны поступать в мышцу, когда она еще не начала расслабляться от предыдущего раздражения (когда писчик еще стоит наверху и не начал опускаться. Посмотреть какой вид имеют кривые.

5. Получение оптимума и пессимума частоты раздражения.Мышцу закрепите в миографе, нерв положите на раз­дражающие электроды. Электроды соедините со стимулятором (ток сверхпороговый, длительность импульсов — 0,5 мс).

До проведения опыта подберите минимальную частоту раздра­жения нерва, при которой мышца будет сокращаться по типу гладкого тетануса. Подведите писчик миографа к барабану кимо­графа и запишите сокращения мышцы при раздражениях нерва ритмическим током частотой 30 Гц, 40 Гц. Обратите внимание на то, что при увеличении частоты раздражения нерва амплитуда гладкого тетануса увеличивается. При частоте раздражения по­рядка 50 Гц амплитуда тетануса становится наибольшей; это — оптимум.

Увеличьте частоту раздражения нерва до 140 Гц. При этом на­блюдается сокращение мышцы на начало раздражения, за кото­рым следует ее расслабление при продолжающемся раздражении нерва; это — пессимум.

Можно доказать, что состояние пессимума не является след­ствием утомления мышцы (Н.Е. Введенский). Попробуйте во вре­мя пессимального расслабления мышцы (частота раздражения нерва 140 Гц) быстро переключить стимулятор на более низкую частоту (50 Гц). После переключения мышца немедленно из со­стояния пессимума перейдет к оптимуму или к одному из видов тетануса — зубчатому или гладкому в зависимости от частоты раз­дражения в данный момент.

Оформление протокола.

1. Зарисовать кривую возбудимости мышцы прямым и непрямым способами.

Рис. 12. Определение возбудимости нерва и мышцы.

Раздражение мышцы: а — непрямое (через нерв); б — прямое (на мышцу). Стрелками обозначены моменты нане­сения раздражения; цифрами — пока­зания шкалы стимулятора, мВ.

2. Зарисовать кривую одиночного сокращения мышцы, а также кривые зубчатого и гладкого тетануса

Рис. 13.Зависимость ха­рактера мышечных сокра­щений икроножной мышцы лягушки от час­тоты раздражения.

1 — одиночные сокращения;

2 — зубчатый тетанус;

3 — гладкий тетанус.

3. Зарисовать схему гладкого тетануса икроножной мышцы, записанного при разной частоте стимуляции нерва. Сделайте вывод о зависимости амплитуды гладкого тетануса от частоты стимуляции нерва. Укажите, при какой частоте возни­кает оптимум и при какой — пессимум.

Рис. 14.Зубчатый и гладкий тетанус, оптимум и пессимум, возникающие в ответ на различную частоту раздражения:

1 — оптимум; 2 — пессимум; 3 — зубчатый тетанус; 4 - одиночные сокращения на возрастающие по силе раздражения

4. Дайте оценку возбудимости нерва и мышцы, сравнив пороги их возбуждения.

5. Сделайте соответствующие выводы:

1-----------------------------------------------------------------------------------------------

2----------------------------------------------------------------------------------------------

3----------------------------------------------------------------------------------------------

Контрольные вопросы для самостоятельной подготовки

1. Прямое и непрямое раздражение мышц.

2. Раздражители и их классификация.

3. Порог раздражения.

4. Одиночное сокращение мышцы.

5. Зубчатый и гладкий тетанус.