Масс-спектрометрические методы исследования.

Масс-спектрометрия.

Введение

Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектральный анализ) – это физический метод измерения отношения массы заряженных частиц материи (ионов) к их заряду (m/z). Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества (рис. 1).

Этот метод, используемый сегодня в тысячах лабораторий и предприятий мира, имеет в своей основе фундаментальные знания природы вещества и использует основополагающие физические принципы явлений. Прежде всего остановимся на том как реализуется этот метод. Приборы, которые используются в этом методе, называются масс-спектрометры или масс-спектрометрические детекторы. Эти приборы имеют дело с материальным веществом, которое как известно, состоит из мельчайших частиц – молекул и атомов. Приборы, в которых регистрация осуществляется электрическими методами, называют масс-спектрометрами, а приборы с регистрацией ионов на фотопластинках - масс-спектрографами. Масс-спектральные приборы состоят из системы ввода пробы (система напуска), ионного источника, разделительного устройства (масс-анализатора), детектора (приемника ионов), вакуумных насосов, обеспечивающих достаточно глубокий вакуум во всей вакуумной системе прибора, и системы управления и обработки данных (рис. 2). Иногда приборы соединяют с ЭВМ.

Масс-спектрометры устанавливают что это за молекулы (то есть, какие атомы их составляют, какова их молекулярная масса, какова структура их расположения) и что это за атомы (то есть их изотопный состав). Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет их массы, вернее соотношение массы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Масс-спектр - это рассортировка заряженных частиц по отношениям массы к заряду.

Следовательно, первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией и по разному осуществляется для органических и неорганических веществ.

Ионизация.

Наиболее старый и наиболее широко применяемый в современной масс-спектрометрии метод ионизации молекул органических соединений - это, так называемый, электронный удар (ЭУ, по-английски EI - Electron Impact). Впервые осуществлен П. Ленардом (1902). Современные источники такого типа построены по принципу источника А. Нира (рис. 3).

Рис. 3. Схема ионного источника типа источника А. Нира: 1 – постоянный магнит; 2 – катод; 3 – выталкивающий электрод; 4 – поток электронов; 5 – ловушка электронов; 6 – ионный луч; 7 – ввод вещества.

Для того, чтобы ионизовать органическое вещество его нужно сначала из конденсированной фазы (жидкость, твердое тело) перевести в газовую фазу, например, нагреть. Затем, их нужно ввести в так называемый источник ионов, где они подвергаются бомбардировке пучком электронов, который можно получить нагревая, например, металлическую ленточку (катод). Можно поместить вещество в конденсированной фазе в источник ионов и там его испарить. Электроны – легкие по сравнению с молекулами отрицательно заряженные частицы – сталкиваясь с молекулами вырывают из электронных оболочек электроны и превращают молекулы в ионы. При этом молекулы часто разваливаются на заряженные фрагменты по определенному для каждого соединения механизму. Именно в результате этого процесса в конечном итоге получится масс-спектр, несущий информацию о структуре молекулы и, часто, настолько характерный для определенного органического соединения, что его называют "отпечатком пальцев", то есть настолько же индивидуальный как рисунок на пальцах человека. Все это должно происходить в вакууме, иначе электроны слишком быстро зарядят молекулы, составляющие компоненты воздуха, а ионы, образовавшиеся из того соединения, которое нас интересует, слишком быстро вновь превратятся в нейтральные молекулы.

Другой способ ионизации - это ионизация в ионно-молекулярных реакциях, называемая химической ионизацией (ХИ, CI - Chemical Ionization). При этом способе источник ионов заполняется каким-либо газом при повышенном давлении (типично используется метан или изобутан, очень редко аммиак и другие газы), который ионизуется все тем же электронным ударом, а в результате большой популяции молекул в источнике начинают происходить ионно-молекулярные раекции, ведущие к образованию ионов-реагентов, которые, в свою очередь взаимодействуют с молекулами интересующего нас вещества, ведя к их ионизации.

Такая ионизация в газовой фазе является "мягкой", то есть образовавшиеся ионы не разваливаются на мелкие фрагменты, а скорее остаются крупными кусками либо чуть меньше, чем исходная молекула, либо даже большее ее за счет присоединения других ионов. Этот метод дает меньше информации о том, как устроена структура молекулы, зато с его помощью легче определить ее молекулярную массу. Это касается, в основном, положительно заряженных ионов.

Для ряда применений очень удобным может оказаться метод PPNICI (Импульсная попеременная регистрация положительных ионов и отрицательных ионов при химической ионизации). В этом методе от одной съемки образца получаются две хроматограммы (и соответственно, две совокупности масс-спектров): одна по положительно заряженным ионам, другая – по отрицательно.

Очень многие органические вещества невозможно испарить без разложения, то есть перевести в газовую фазу. А это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом. В последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений. Сегодня используются, в основном, методы ионизации при атмосферном давлении - ионизация в электроспрее (ESI) или - химическая ионизация при атмосферном давлении - APCI (и ее подвид с дополнительной фотоионизацией - APPI), а также ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).

В первом случае жидкость (интересующие нас соединения с растворителем) вырывается под давлением вместе с коаксиально подаваемым разогретым газом (азотом) из узкого капилляра (на самом деле, иглы, которая находится под повышенным потенциалом - 5 - 10 кВ) с огромной скоростью и прямо в этой струе мелкодисперсного тумана с оболочек молекул срываются электроны, превращая их в ионы. Большая часть растворителя при движении этой струи переходит в газовую фазу и не попадает в отверстие входного конуса источника ионов.

В режиме химической ионизации при атмосферном давлении потенциал прикладывается не к игле, через которую поступает жидкость, а к электроду в области распыления, что приводит к образованию коронного разряда. В этом случае фрагментация значительно меньше, чем в предыдущем - электроспрее (ESI).

В методе MALDI лазерный луч вырывает ионы с поверхности мишени, на которую нанесен образец со специально подобранной матрицей.

Эти методы, применяемые для ионизации относительно "мягких" соединений, составляющих органическую материю. "Мягких" означает, что для того, чтобы перевести молекулы органики в ионы нужны относительно небольшие энергии. Для ионизации неорганических материалов (металлы, сплавы, горные породы и т.д.) требуется использование других методов. Энергии связи атомов в твердом теле гораздо больше и значительно более жесткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы.

Первый метод, наиболее распространенный, ионизация в индуктивно-связанной плазме. Индуктивно-связанная плазма (ИСП, ICP) образуется внутри горелки, в которой горит, обычно, аргон. Аргон, вообще говоря, инертный негорючий газ, поэтому, чтобы заставить его гореть, в него закачивают энергию, помещая горелку в индукционную катушку. Когда в плазму аргоновой горелки попадают атомы и молекулы, они моментально превращаются в ионы. Для того, чтобы ввести атомы и молекулы интересующего материала в плазму их обычно растворяют в воде и распыляют в плазму в виде мельчайшей взвеси. Другой метод состоит в том, чтобы превратить вещество в газ. Например, это делают с помощью мощного лазерного луча, который "взрывает" кратер в подставленном под него кусочке материала, переводя небольшую его часть в газообразное состояние (лазерная абляция).

Другой способ - это так называемая термоионизация или поверхностная ионизация. Анализируемое вещество наносится на проволочку из тугоплавкого металла, по которой пропускается ток, разогревающий ее до высокой температуры. За счет высокой температуры нанесенное вещество испаряется и ионизируется. Этот метод обычно используется в изотопной масс-спектрометрии.

Два других метода могут применяться для ионизации проводящих ток материалов. Это искровая ионизация и ионизация в тлеющем разряде.

Надо отметить, что начиная от ионного источника и до детектора масс-спектрометр представляет собой вакуумный прибор. Довольно глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра, а при его отсутствии ионы просто рассеятся и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы).

Масс-анализаторы.

Итак, мы получили ионы. Поскольку это заряженные частицы, мы можем с помощью электрического поля вытянуть их из той области, где они образовались. Теперь, начинается второй этап масс-спектрометрического анализа – сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z). Это происходит в той части масс-спектрометра, которая называется "масс-анализатором".

Масс-анализаторы – устройства для пространственного или временного разделения ионов с различными значениями m/z в магнитном или электрическом полях или их комбинациях. Различают статические и динамические анализаторы. В статических ионы разделяются в постоянных или практически неизменяющихся за время их движения через анализатор магнитных полях. Ионы с различными значениями m/z движутся в таком анализаторе по разным траекториям и фокусируются либо в разных местах фотопластинки, либо последовательно на щель детектора в результате плавного изменения напряженности электрического и магнитного полей анализатора. В динамических анализаторах разделение ионов происходит под воздействием импульсных или радиочастотных электрических полей с периодом изменения меньшим или равным времени пролета ионов через масс-анализатор. Ионы с различными значениями m/z, как правило, разделяются по времени пролета определенного расстояния. Давление в анализаторах должно быть достаточно низким, чтобы избежать рассеяния ионов на молекулах остаточных газов. Основная характеристика масс-анализатора – его разрешающая способность, или разрешающая сила R. Она характеризует способность анализатора разделять ионы с незначительно отличающимися друг от друга массами. Наиболее часто применяют статические масс-анализаторы с однородным магнитным полем (одинарная фокусировка) или комбинацией электрического и магнитного полей (двойная фокусировка). В масс-анализаторах с одинарной фокусировкой (рис. 4) ионный луч, сформированный в источнике ионов, выходит из щели шириной S1 в виде расходящегося ионного пучка и в магнитном поле разделяется на пучки ионов с различными значениями m/z.

Рис. 4. Схема масс-анализатора с однородным магнитным полем: S1 и S2 – щели источника и детектора ионов; ОAВ – область однородного магнитного поля Н, перпендикулярного плоскости рисунка; тонкие сплошные линии – границы пучков ионов с разными m/z; r – радиус центральной траектории ионов.

Под действием поля, силовые линии которого направлены перпендикулярно направлению движения ионного пучка, ионы двигаются по круговой траектории с радиусом r = (2Um_n/zH²)^1/2, где U – напряжение, ускоряющее ионы, m_n - масса иона, z - заряд иона, H - напряженность магнитного поля. Ионы с одинаковой кинетической энергией, но с разными массами или зарядами проходят через анализатор по различным траекториям.

Несмотря на значительные преимущества современных магнитных масс-анализаторов (рекордная чувствительность, однозначность идентификации, большой рабочий диапазон масс, широкий линейный диапазон), они обладают двумя основными "недостатками" - эти приборы большие как по размерам, так и по стоимости. Там, где нельзя без них обойтись, им нет альтернативы (органический анализ с высоким разрешением, анализ изотопных соотношений, элементный анализ на предельной чувствительности), но в современном мире существуют тысячи аналитических применений масс-спектрометрии, для многих из них годятся приборы и меньшего калибра.

Существует более 10 типов динамических масс-анализаторов: квадрупольный, время-пролетный, циклотронно-резонансный, магнитно-резонансный, радиочастотный, фарвитрон, омегатрон и др. Ниже рассмотрены наиболее широко применяемые масс-анализаторы.

Квадруполь.

Квадрупольный масс-анализатор представляет собой квадрупольный конденсатор (рис. 5), к парам параллельных стержней которого приложены постоянное напряжение U и переменное высокочастотное напряжение U₀cos ωt (ω - частота, t - время); их суммы для каждой пары равны по величине и противоположны по знаку.

Рис. 5. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 – высокочастотный генератор; 2 – генератор постоянного напряжения; 3 – генератор развертки; 4 и 5 – источник и детектор ионов.

Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся в камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным объемным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и у. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через квадруполъный конденсатор, у ионов с др. значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжении или частоты. Для современных квадрупольных масс-спектрометров R = 8000.

Создание квадрупольных масс-анализаторов стало революцией в масс-спектрометрии. Магнитные масс-спектрометры требуют использования высоких напряжений (тысячи вольт), а квадрупольные нет, и это упрощает его конструкцию, меньшие размеры вакуумной части упрощают систему создания вакуума. Масс-спектрометры уменьшились в размерах, стали проще в эксплуатации и, что самое главное, намного дешевле, что открыло возможность использовать этот аналитический метод многим тысячам пользователей.