Десорбция микроорганизмов при их количественном учете в почве

Для правильного количественного учета микроорганизмов в почвах необходимо вызвать три процесса: 1) разрушить почвен­ные агрегаты, 2) десорбировать почвенные микроорганизмы с твердых поверхностей, 3) разделить находящиеся в почве микроколонии на отдельные составляющие их клетки. Все три процес­са вызываются одинаковыми воздействиями, хотя очень трудно осуществить их полностью. Типы воздействия могут быть меха­ническими и химическими. Механические воздействия — это растирание, обработка почвенной суспензии на пропеллерной мешалке (миксер, микроизмельчитель тканей, магнитная мешалка), ультразвуковая (УЗ) обработка. Химические воздействия — это обработка щелочью или раствором пирофосфата натрия, кото­рый обладает щелочным действием, воздействие поверхностно­активными веществами (ПАВ), например додецилсульфатом нат­рия, обработка ферментами.

Наиболее эффективными оказались механические обработ­ки. Для учета бактерий методом посева или прямым микроско­пическим методом используют УЗ небольшой частоты и мощ­ности, так как в противном случае будут разрушены сами клетки. Собственно почвенные бактерии гораздо более устойчивы к УЗ, чем их лабораторные культуры. Существует такая закономер­ность: чем крупнее клетки, тем больше они разрушаются УЗ. Поэтому для грибов, как более крупных организмов УЗ доволь­но губителен и при учете грибов лучше применять пропеллерную мешалку, добиваясь разрушения почвенных агрегатов и дробления мицелия на однородные части длиной 15-30 мкм при сохранении ими жизнеспособности и целостности конидий и половых спор.

Если количественный учет микроорганизмов в почве прово­дится без тщательной предварительной подготовки почвенной суспензии, получают совершенно неверные результаты. Предва­рительная обработка почвенной суспензии повышает определяе­мое количество микроорганизмов в зависимости от типа и состо­яния почвы в 3-300 раз. Особенно сильный эффект получается для сухих оструктуренных почв. Малый эффект наблюдается для сильно увлажненных нижних минеральных горизонтов почв. При традиционном способе подготовки почвенной суспензии путем 10-минутного перемешивания почвенной суспензии в колбе мож­но получить, хотя и не абсолютные, но годные для сравнения результаты, например, для разных делянок одной и той же почвы одинаково увлажненных, но содержащих разные количества удоб­рений. Такое сравнение невозможно для почв разных типов или почвенных образцов из разных генетических горизонтов, а также для сравнения сухих и увлажненных почв. Часто делают вывод о том, что при высушивании почв клетки погибают, а они по край­ней мере частично переходят в адсорбированное состояние и не учитываются.

Если старый метод давал различие в содержании бактерий в разных типах почв в 2-3 раза, то с применением новых методов диспергирования почв и десорбции микроорганизмов оказалось, что эти различия достигают десятков и даже сотен раз.

2.3 Активность адгезированных клетокАдгезированные клетки находятся в специфической микрозо­не, образующейся на границе раздела жидкости и твердого тела, где адсорбируется большинство полимерных органических ве­ществ в том числе и гумус, происходит адсорбция гидролити­ческих ферментов. Поскольку большинство почвенных частиц заряжены отрицательно, здесь концентрируются положительно заряженные органические мономеры, повышается концентрация адсорбированных катионов (К, NH₄ Са, Mg, Н), уменьшается концентрация неорганических и органических анионов (рис. 95). Активность адгезированных клеток по сравнению со свободны­ми часто резко изменяется. Она может быть больше или меньше, чем у свободных в за­висимости от того, окажутся ли условия в микрозоне на поверхности раздела более или менее благоприятными, чем в почвенном растворе. Обычно эта микрозона более благоприятная, так как адсорбированные гидролазы осуществляют гидролиз полимеров и появляются лег­кодоступные мономеры (сахара, аминокислоты, органические кислоты, спирты). Микробы лучше обеспечены минеральными питательными веществами в том числе фосфором и железом, которые также осаждаются на поверхности частиц. Автотрофные нитрификаторы используют преимущественно адсорбиро­ванный аммоний.

Однако на поверхности раздела жидкой и твердой фаз могут концентрироваться и токсичные вещества, такие как тяжелые металлы, антибиотики. Здесь может быть меньше отрицательно заряженных органических кислот или аминокислот и тогда адге­зированные микробы будут развиваться хуже. На поверхности раздела отрицательно заряженных частиц в кислых почвах будет более низкое pH из-за высокой концентрации ионов водорода, что также будет оказывать влияние на развитие микробов. Почвенные биохимики предложили молекулярный рН-метр для измерения pH на поверхности твердых частиц. На поверхности частицы адсорбируют фермент и затем определяют оптимальное pH для проявления его максимальной активности. Это осуществляется следующим образом. Находят оптимум pH действия фермента для двух растворов. В одном растворе фермент находится в свободном, в другом — в адсорбированном состоянии. Для адсорбированного фермента наблюдается «кажущийся» сдвиг в щелочную область. Он может достигать единицы pH и более. В действительности никакого сдвига рН-оптимума для адсорбированного фермента не происходит. Просто он находится в зоне с более низкими значениями pH. Доказано, что в этой зоне происходит изменение и концентрации, и активности ионов водорода. С помощью ферментов можно определять pH в микрозонах. Изменение pH на поверхности влияет не только на активность фермента, но и на активность адгезированных клеток. Фермен ты могут адсорбироваться различным образом. Фермент представляет собой белковую глобулу с активным центром, к которому подходит субстрат. Глобула имеет положительно и отрицательно заряженные, гидрофильные и гидрофобные участки. Поэтому на разных почвенных частицах адсорбция проходит раз­ными сторонами. Если закрывается активный центр, фермент теряет активность. Обычно при адсорбции изменяется конфор­мация (конфигурация) молекулы, что ведет к изменению актив­ности фермента, но он становится более устойчивым к воздей­ствию неблагоприятных факторов (высушивание, хранение, температурные воздействия и др.). Фермент может быть закрыт органоминеральным гелем или может попасть в межплоскостные пространства минералов типа монтмориллонита. Все это будет отражаться на его активности. Молекула субстрата может быть очень маленькой (Н₂0₂) или очень крупной, например, белковая молекула для протеазы (на рисунке обозначена чер­ными кружками).

Адсорбированные (иммобилизованные) ферменты в последние 30 лет широко применяются в биотехнологии. Однако, как обна­ружилось, природа использует эти механизмы уже миллиарды лет.

В настоящее время хорошо изучено влияние адсорбентов на различные типы брожений, на азотфиксацию, нитрификацию, использование кислых и основных аминокислот, окисление мета­на, водорода, использование некоторых углеводородов. Наиболее сильно влияние твердых частиц проявляется в разбавленных раст­ворах, каковым, в частности, обычно является почвенный раст­вор. Здесь микроорганизмы часто не могут развиваться в растворе из-за низкой концентрации питательных веществ, но на поверх­ности частиц они развиваются, так как здесь концентрация пита­ния оказывается гораздо больше. Это явление было подробно изу­чено водными микробиологами для олиготрофных водоемов. Влияние адсорбента может оказывать различный и даже прямо противоположный эффект в зависимости от взаимного рас­положения частиц адсорбента и клеток. В случае а на клетки будет оказывать влияние специфика поверхности раздела жидкости и твердого тела. В случае б адсорбент не будет оказы­вать непосредственного действия на клетки. В случае в клетки покрываются чехлом из коллоидных частиц гумуса или глинистых минералов и их окружение, влияющее на жизнедеятельность, будет особым. Четвертый случай г представляет собой заключение клеток внутри конгломерата из частиц. Часто активность клеток в таких условиях вообще невозможна.

Активность будет зависеть от плотности контакта с частицами. Показано 10 случаев более или менее плотного контакта клетки бактерии с почвенной частицей, покрытой пленкой из органического и минерального геля: от полного удаления от частицы до расположения на поверхности геля, внутри геля или на поверхности минеральной частицы. Поверхность минеральной частицы показана на рисунке черной линией, а органоминеральный слой окрашен в серый цвет. Клетки со стебельком, жгутиками, фимбриями, с капсулой или без нее будут располагаться в разных по свойствам микрозонах. Особое положение занимают клетки, погруженные в органоминеральный гель (собственно иммобилизованные клетки). Во многих случаях они вообще не могут делиться. Ясно, что в каждом случае микросреда для развития клетки будет разной, а клетка всегда развивается в микросреде.

Эффективный способ борьбы с прикрепившимися фитопатогенными микроорганизмами имеется у растительных и животных организмов. Если клетки прикрепились и нет возможности от них избавиться, корень или другой орган растения или животного сбрасывает клетки своего эпителия и таким образом освобождается от вредных микроорганизмов.

Жидкая фаза почвы

Жидкая фаза почвы (почвенный раствор) обычно располагается в капиллярах или образует пленки разной толщины. Капилляры и пленки могут быть значительно толще или тоньше клеток микроорганизмов. Сравнительно редко после дождей, полива или подъема уровня фунтовых вод в почве появляются большие объемы воды, которые движутся под действием сил гравитации. Для жидкой фазы почвы характерна микрозональность в отношении содержания газов, органических веществ, pH, Eh и др. На протяжении некоторого времени микрозоны могут различаться и по потенциалу влаги. Он может быть различным в тече­ние долгого времени в разных почвенных горизонтах

Жидкая фаза почвы всегда содержит некоторое количество минеральных, органических и органоминеральных веществ в молекулярном или коллоидном состоянии, а также растворен­ные газы. Однако концентрация питательных веществ в почвен­ном растворе обычно очень мала, и развитие микроорганизмов в объеме почвенного раствора происходит сравнительно редко. Они развиваются в адгезированном состоянии. Таким образом, глав­ная функция почвенного раствора заключается в переносе ве­ществ и обеспечении микроорганизмов водой. Снабжение пита­тельными веществами обычно проходит два этапа: 1) перенос питательных веществ с почвенным раствором на твердую поверх­ность и концентрирование на ней, 2) использование адсорбиро­ванных веществ адгезированными микробными клетками.

Почвенный раствор в сотни и тысячи раз менее концентриро­ван по сравнению с обычно применяемыми микробиологическими питательными средами, например средой Чапека, мясо-пептон- ным бульоном или крахмало-аммиачной средой. Отсюда возник­ла идея о необходимости применения при культивировании поч­венных микроорганизмов очень разбавленных питательных сред, особенно в тех случаях, когда исследователь хочет приблизиться к воссозданию естественной обстановки. В этих условиях удает­ся выделять и изучать олиготрофы. Микроорганизмы успешно развиваются в разбавленных питательных растворах и здесь их вырастает гораздо больше, чем на богатых средах. Так, на разбав­ленном в 10 раз мясо-пептонном агаре вырастает в 5-10 раз больше колоний, чем на исходном, на агаризованной воде — еще боль­ше, но их уже нужно подсчитывать через месяц, а не через три дня, как на МПА и рассматривать в бинокулярную лупу, так как колонии очень малы. Трудность изучения состоит в том, что они растут очень медленно и экспериментатор должен затратить дли­тельное время. Необходимо также иметь в виду, что в отдельных микрозонах и в естественной почве могут создаваться высокие концентрации растворенных и нерастворенных органических питательных веществ. Примером микрозон первого типа может служить ризоплана с непрерывным поступлением большого ко­личества корневых выделений, а примером микрозон второго типа— отмерший корешок растения или погибший дождевой червь.