Глава 4. Программа и объём выполненных работ
Эксперименты по биотестированию на определение чувствительности рыб рода Barbus, проводились на базе лаборатории по биотестированию в главном отделении Рос НИИВХ, с помощью специального аппарата ToxProtect64 (рис.1). Данная установка позволяет отслеживать плавательную активность рыб в толще воды, с помощью инфракрасных датчиков, расположенных по всему периметру аквариума (рис.2). Определение уровня активности производится благодаря перекрыванию световых лучей, количество которых установка пересчитывает как величина активности рыб за минуту. Критерием токсичности воды в экспериментах по биотестированию являлось снижение общей активности рыб ниже 3 свето-перекрываний/мин, и/или повышение поверхностной активности выше 2 свето-перекрываний/мин для барбуса суматранского и снижение общей активности рыб ниже 5 свето-перекрываний/мин, и/или повышение поверхностной активности выше 5 свето-перекрываний/мин для барбуса золотистого. Так же оценивался показатель удельной активности – соотношение показателей общей и поверхностной активности. В случае возникновения критической ситуации (токсичности) система подаёт звуковой и световой сигнал [27].
Аппарат ToxProtect64
Объём аквариума составляет 10 л. Температура воды в аквариуме на протяжение всего эксперимента составляла 20-24 °C. В каждом эксперименте было задействовано 10 рыб. Для более точных результатов была сформирована средне размерная и однополая группа из здоровых и демонстрирующих высокую активность особей. В течении эксперимента рыб не кормили. После каждого эксперимента все рыбы менялись. Продолжительность экспозиции тест-организмов в испытуемой среде составляла 24 ч. Мертвую рыбу регистрировали по отсутствию признаков движения и дыхания (рис 3, 4) [27].
Тест-организмы
В качестве тест-объекта для определения токсичности воды в автоматической системе биосигнализации ToxProtect64 использовалась лабораторная культура рыб рода Barbus, Барбус огненный или золотистый Pethia conchonius (Hamilton, 1822) (рис. 5) и Барбус суматранский или тигровый Puntigrus tetrazona (Bleeker, 1855) (рис 6). Данный вид рыбы отвечает таким показателям, требуемым для эксплуатации ToxProtect64 как размерам (не более 60 мм), степенью подвижности, стайностью, обитанием в среднем и нижнем слое воды, что необходимо для определения показателя поверхностной активности.
Барбус огненный или золотистый Pethia conchonius (Hamilton, 1822). Данный вид в естественных условиях населяет воды Бангладеш, северо-восточной части Индии и Юго-восточной части Азии. Предпочитает стоячую воду [28].
Барбус огненный обладает овальной формой тела, плоское по бокам. В аквариуме их длинна достигает 5 см, в природных условиях могут вырастать до 8 см. Ярко выражен половой диморфизм – самка имеет светло-оливковый или желтоватый цвет, самец имеет сильный огненный отлив, в начале хвостового стебля располагается чёрное пятно.
Оптимальная температура для содержания данного вида в аквариумных условиях 18 – 25 °C, минимальная температура, которую может перенести барбус без серьёзных последствий для организма 15 °C, жёсткость воды может составлять 4—18°. Для нормальной жизнедеятельности в аквариуме желательно иметь не менее 5 особей, так как вид ведёт стайный образ жизни. Особи в аквариуме располагается в средних слоях толщи воды.
Барбус суматранский или тигровый Puntigrus tetrazona (Bleeker, 1855). Вид лучепёрых рыб семейства карповых [29]. Обитает в водоёмах островов Суматра, за что и получил своё название, и Калимантан.
Данный вид обладает высоким, плотным сильно сжатым с боков телом. Окраска золотисто-розовая спина более тёмная, чем брюшко. По бокам располагаются вертикальные чёрные полосы. Половой диморфизм выражен размером и окраской тела. Их длинна может достигать 5 см.
Оптимальная температура для содержания должна быть 22 - 24°C, могут кратковременно переносить температуру не ниже 15°C. Жёсткость воды до 17°, pH 6,5—7,0. Наличие особей в аквариуме должно составлять не менее 5, так как вид является стайным. Располагаются в средних и нижних слоях толщи воды.
Оба вида соответствуют параметрам необходимым для проведения экспериментов в аппарате ToxProtect64 так как: их размеры не превышают 60 мм, являются малоподвижными, обитают в нижних и средних слоях толщи воды, не прихотливы.
Химические вещества используемые в экспериментах
Для проведения опытов, были взяты 3 химических вещества: соединение меди (CuSO4*5H2O) – медный купорос, цинка Zn(CH3COO)2*2H2O – ацетат цинка и хрома (K2CrO7) – дихромат калия. Эти соединения были выбраны в связи с тем что, они являются самыми распространёнными загрязняющими веществами в городе Екатеринбург. По нормативным документам они относятся к 1 классу опасности (цинк) и 2 классу опасности (медь, хром). Являются токсичными для всех живых организмов и могут вызвать серьёзные физиологические отклонения, при определённых концентрациях.
Воздействие химических веществ на живой организм
Сульфат меди. Неорганическое соединение, медная соль серной кислоты с формулой (CuSO4*5H2O). Нелетучее, не имеет запаха. Безводное вещество бесцветное, непрозрачное, очень гигроскопичное. Сульфат меди(II) хорошо растворим в воде [30]. Сульфат меди используется в медицине, сельском хозяйстве, в пищевой промышленности, строительстве и в металлургии, отрасли транспорта и связи, текстильной, авиационной, электротехнической промышленности.
Медь входит в список основных загрязняющих веществ питьевой воды Свердловской области. Повышенное содержание меди в воде ведёт к поражению почек и печени. В области лишь 17% централизованных источников водоснабжения имеют согласованные с органами Роспотребнадзора и утвержденные в установленном порядке проекты зон санитарной охраны [31]. В области 90% населённых пунктов, на сегодняшний день не удовлетворяют требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01 «Вода питьевая» [31].
Медь является жизненно важным элементом, который входит в состав многих витаминов, гормонов, ферментов, дыхательных пигментов, участвует в процессах обмена веществ, в тканевом дыхании и т.д. [30]. В организм попадает в основном с пищей. Наиболее высокое содержание меди в морских продуктах, крапиве, бобовых, яблоках, шпинате и др. Лучше всего в организме человека усваивается двухвалентная медь. В крови медь связывается с сывороточным альбумином (12-17%), аминокислотами - гистидином, треонином, глутамином (10-15%), транспортным белком транскуприном (12-14%) и церулоплазмином (до 60-65%) [30]. Суточная норма меди в организме составляет 2-3 мг. Недостаток меди так же отрицательно сказывается на здоровье человека. Токсичной концентрацией для человека считается 200 мг/сутки. Больше всего медь откладывается в печени, почках, мозге и крови.
Причины повышенной концентрации меди в организме человека. Вдыхание пыли и паров соединений меди на производстве, бытовое отравление растворами соединений.
Влияние избытка меди в организме.
· функциональные расстройства нервной системы (ухудшение памяти, депрессия, бессонница);
· при вдыхании паров может проявляться "медная лихорадка" (озноб, высокая температура, проливной пот, судороги в икроножных мышцах);
· воздействие пыли и окиси меди может приводить к слезотечению, раздражению конъюнктивы и слизистых оболочек, чиханию, жжению в зеве, головной боли, слабости, болям в мышцах, желудочно-кишечным расстройствам;
· нарушения функций печени и почек;
· поражение печени с развитием цирроза и вторичным поражением головного мозга, связанным с наследственным нарушением обмена меди и белков (болезнь Вильсона-Коновалова);
· аллергодерматозы;
· увеличение риска развития атеросклероза;
· гемолиз эритроцитов, появление гемоглобина в моче, анемия [30].
Ацетат цинка (цинк уксуснокислый), Zn(O2CCH3)2 — химическое соединение, уксуснокислая соль цинка (рис 7). Бесцветные кристаллы, растворимые в воде и органических растворителях (метанол, ацетон, анилин, пиридин). Встречается в виде кристаллогидратов и безводных форм. Может быть получено путём растворения карбоната цинка или цинка в уксусной кислоте [32]. Применяют в пищевой промышленности, при деревообработке, строительстве, медицине, в металлургии и машиностроение.
Цинк является одним из самых важнейших элементах в организме. Он оказывает влияние на более чем 400 биохимических реакций, необходим для образования алкогольдегидрогеназы, обезвреживает спирты в организме. Цинк так же очень важен для образования ферментов, которые синтезируют нуклеиновые кислоты, участвуют в деление клеток, распаде углеводов и белков [33]. Присутствует в составе инсулина, участвует в процессах передачи нервных импульсов, необходим для нормальной работы иммунной системы. При дефиците цинка больше всего страдает репродуктивная система. Ухудшается зрение, образование язв на коже и слизистых, кожные заболевания, продолжительные простудные заболевания, аллергии, уменьшение содержания инсулина [33]. В организм цинк попадает с пищей. Наибольшее его количество содержится в морепродуктах брокколи, орехах и семенах, и др. растительной пище. С пищей животного происхождения цинк поступает в организм в более усвояемой форме. Суточная норма меди составляет примерно 8 мг для женщин и 11 мг для мужчин. В отличие от меди цинк не может откладываться в организме. Токсической концентрацией для человека является 150мг/сутки. С пищей такого большого количества этого микроэлемента невозможно, но токсическую концентрацию можно получить при:
· контакт с соединениями цинка на производстве;
· прием пищи из гальванизированных контейнеров, оцинкованной посуды;
· превышение дозировки БАДов и медикаментов (включая цинксодержащие мази);
· нарушения обмена цинка [33].
Цинк может очень быстро всасываться через кожу и вызывать отравление. При таксиками наблюдаются боли в мышцах, груди и животе, развитие тошноты и рвоты, учащённое сердцебиение, развитие отдышки.
Дихромат калия (двухромовокислый калий, бихромат калия), (K2CrO7) - ихромат калия – это вещество неорганической природы происхождения, его получение производится путем химического синтеза [34].
Хром имеет широкий ряд применения: металлургия, машиностроение, кораблестроение, производство оружия, строительство, производство металлокерамических изделий, медицина.
В организм хром попадает в основном с пищей. Больше всего его содержится в бобовых и семенах, морепродуктах, ягодах, фруктах и молочных продуктах. Оптимальное для человек количество хрома в сутки составляет от 0,05 мг до 0,2 мг. Опасная для здоровья доза составляет 2 г. Хром необходимый организму элемент так как он отвечает за выработку инсулина, регулирование обмена веществ и расщепление углеводов. Некоторые люди подвержены риску отравлению хромом на металлургических предприятиях путём вдыхания хромовой пыли.
При недостаточном количестве хрома в организме у у человека наблюдаются головные боли, проблемы со сном, ослабленный иммунитет, развитие сахарного диабета и атеросклероза. При избыточном количестве хрома в организме у человека может возникнуть целы ряд заболеваний. Самым распространённым является дерматиты и экземы, способствует развитию заболеваний пищеварительной системы. При избытке хрома нарушается работа почек и печени.
При обследовании проб воды Волчихинского водохранилища – главного источника снабжения водой города Екатеринбурга, обнаружено превышение концентрации меди, марганца, цинка, нитратов и прочих вредных веществ, а также загрязнение микроорганизмами [35].
Таблица 1
Сравнительная таблица ПДК для питьевой воды и рыбохозяйства
| питьевая вода, мг/л | водоёмы рыбохозяйственного наз-ия, мг/л | |
| медь | 0,001 | |
| цинк | 0,01 | |
| хром | 0,05 | 0,001 |
Так как эксперимент проводился на рыбах, ПДК были взяты для рыбохозяйственных нормативов. Были выбраны концентрации 1 ПДК, 5 ПДК и 10 ПДК. Таким образом, 1ПДК меди составляет 0,001 мг/л. 1 ПДК цинка составляет 0,01 мг/л, а 1 ПДК хрома 0,001 мг/л. Вода использовалась водопроводная, отстоянная, после завершения эксперимента вся вода сливалась из аквариума, аквариум промывался и заливалась новая вода. Для мониторинга брались особи крупного размера с ярким окрасом, что свидетельствовало о их нормальном физическом состоянии. По завершению каждого эксперимента все рыбы заменялись новыми. Каждое исследование проводилось в течение 24 часов. Эксперимент был проведён в период апрель – май.
Результаты исследований
В контрольных условиях в отстоянной водопроводной воде с двумя приемами пищи картина поведения в течении суток рыб вида барбус суматранский по тестируемым признакам представлена на рисунке ниже.
Рисунок 8. Показатель общей активности барбуса суматранского при нормальных условиях
Рисунок 9. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при нормальных условиях
Рисунок 10. Удельный показатель активности барбуса суматранского при нормальных условиях
Общая активность рыб (Activitycount), поверхностная активность (CoveredLEDstop), удельная активность (Specificactivity) в контрольных условиях. Информация показывает, что общая активность рыб колеблется в пределах от 5 до 15 свето-перекрываний/мин, в среднем 10 свето-перекрываний/мин. Наблюдается два всплеска активности (в 00 и в 12 часов) до 20 свето-перекрываний/мин в период кормления. В утренние часы (6-8 часов) активность может снижаться до 4 свето-перекрываний/мин. Поверхностная активность данного вида очень низкая и ее всплески вызваны процессами кормления. В контрольных условиях она не превышает 2 свето-перекрывания/мин. Показатели удельной активности зависят от поверхностной и в контрольных условиях близки к 0.
Картина поведения в отстоянной чистой воде в течении суток рыб вида барбус огненный по тестируемым признакам:
Рисунок 11. Показатель общей активности барбуса огненного при нормальных условиях
Рисунок 12. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при нормальных условиях
Рисунок 13 Удельный показатель активности барбуса огненного при нормальных условиях
Информация показывает, что общая активность рыб колеблется в пределах от 15 до 30 свето-перекрываний/мин, в среднем 20 свето-перекрываний/мин. Наблюдается два всплеска активности (в 13 и в 07 часов) до 35 свето-перекрываний/мин в период кормления. Ночью (2-6 часов) активность может снижаться до 10 свето-перекрываний/мин. Поверхностная активность данного вида выше по сравнению с барбусом суматранским.
Медь. (CuSO4*5H2O) – медный купорос.
1. Для проведения первого эксперимента использовался медный купорос в количестве 1 ПДК (0,001 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 1,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста – барбус суматранский. 
Рисунок 14. Показатель общей активности барбуса суматранского при 1 ПДК медного купороса
Рисунок 15. Показатель поврхностной активности барбуса суматранского при 1 ПДК медного купороса
Рис. Рисунок 16 Удельный показатель активности барбуса суматранского при 1 ПДК медного купороса
Из выше приведённых графиков мы видим: при введении в воду 1 ПДК медного купороса, средний показатель общей активности равен 7, что соответствует нормальной активности рыб. Показатель поверхностной активности был выше нормы. Это говорит о том что рыбы среагировали на добавление химиката. Предполагается что, медь обжигает жабры рыбы и она поднимается на поверхность в поисках другого источника кислорода. В течение эксперимента погибла одна особь. Однако отклонений в поведении барбусов практически не наблюдается.
2. Мы получили следующие результаты при участии барбуса огненного в качестве биотеста, на 1 ПДКА медного купороса:
Рисунок 17. Показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК медного купороса
Рисунок 18. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 1 ПДК медного купороса
Рисунок 19. Удельный показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК медного купороса
При введении в воду 1 ПДК медного купороса, средний показатель общей активности равен 12, что ниже нормы. Показатель поверхностной активности был выше нормы. Смертность при данной концентрации не наблюдалась.
3. При концентрации 5 ПДК (0,005 мг) медного купороса, 7,5 мг на 15 литров, барбус суматранский показал следующую активность:
Рисунок 20. Показатель общей активности барбуса суматранского при 5 ПДК медного купороса
Рисунок 21. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 5 ПДК медного купороса
Рисунок 22. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 5 ПДК медного купороса
Из этих данных мы видим что, показатель общей активности рыб равен 5. Падение активности наблюдалось уже после 2 часов после начала эксперимента. Показатель поверхностной активности был значительно выше. В течение эксперимента 3 раза срабатывал сигнал предупреждения. Это говорит о том, что биотесты находились в предтоксичном состоянии. Смертность при данной концентрации составила 10%.
4. При концентрации 5 ПДК (0,005 мг) медного купороса, 7,5 мг на 15 литров, барбус огненный показал следующую активность:
Рисунок 23. Показатель общей активности барбуса огненного при 5 ПДК медного купороса
Рисунок 24. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при ПДК медного купороса
Рисунок 25. Удельный показатель активности барбуса огненного при 5 ПДК медного купороса
Показатель общей активности равен 5, что в 4 раза меньше нормы. Поверхностная активность так же мыла значительно выше. Рыбы начали проявлять низкую активность сразу после добавления химического вещества в аквариум. По окончанию эксперимента смертность составила 20%.
5. При 10 ПДК (0,01 мг), раствора 15 мл на 10 л барбус суматранский показал следующую активность:
Рисунок 26. Показатель общей активности барбуса суматранского при 10 ПДК медного купороса
Рисунок 27. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 10 ПДК медного купороса
Рисунок 28. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 5 ПДК медного купороса
Как видно из графиков, барбусы сначала показали нормальную активность. Но через 7 часов активность начала постепенно снижаться и через 9 часов установка дала сигнал тревоги, что свидетельствует об острой токсичности воды. При данной концентрации смертность вида составила 30%.
6. Результаты эксперимента на барбусе огненном:
Рисунок 29. Показатель общей активности барбуса огненного при 10 ПДК медного купороса
Рисунок 30. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 10 ПДК медного купороса
Рисунок 31. Удельный показатель активности барбуса огненного при 10 ПДК медного купороса
На первом графике видно, что активность начала падать уже через 30 минут после начала эксперимента. Показатель поверхностной активность был очень высоким, что свидетельствует о том, что рыба почти всё время эксперимента держалась верхних слоёв толщи воды, что не характерно для данного вида. Смертность составила 60%.
Цинк. Zn(O2CCH3)2 – ацетат цинка.
7. Для проведения дальнейшего эксперимента использовался ацетат цинка в количестве 1 ПДК (0,01 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 15 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста – барбус суматранский.
Рисунок 32. Показатель общей активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка
Рисунок 33. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка
Рисунок 34. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка
Показатель общей активности равен 5. В течение всего эксперимента установка дала 3 предупреждения, первый был после 2 часов после старта. Сигнал тревоги включился через 10 часов. Смертность 60%.
Показатели активности барбуса огненного при концентрации 1 ПДК 
Рисунок 35. Показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка
Рисунок 36. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка
Рисунок 37. Удельный показатель активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка
Как видно из графиков, показатель общей активность очень низкий, а показатели поверхностной активности очень высокий. Установка дала сигнал предупреждения через 2,5 часа и сигнал тревоги через 18 часов. Смертность составила 40%.
8. При 5 ПДК (0,05 мг), ацетата цинка,75 мл раствора на 15 литров воды , барбус суматранский.
Рисунок 38. Показатель общей активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка
Рисунок 39. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка
Рисунок 40. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка
При данной концентрации общая активность была критически низкой уже через 4 часа после начала эксперимента. Смертность составила 90%.
9. При 5 ПДК барбус огненный показал следующие результаты: 
Рисунок 41. Показатель общей активности барбуса огненного при 5 ПДК ацетата цинка 
Рисунок 42. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 5 ПДК ацетата цинка. 
Рисунок 43. Удельный показатель активности барбуса огненного при 5 ПДК ацетата цинка
Сигнал тревоги сработал через 7,5 часов. Смертность составила 80%. Активность была в критическом состоянии.
Хром. (K2CrO7) – дихромат калия.
10. Для проведения этого эксперимента использовался дихромат калия в количестве 1 ПДК (0,001 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 1,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста – барбус суматранский.
Рисунок 44. Показатель общей активности барбуса суматранского при 1 ПДК дихромата калия
Рисунок 45. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 1 ПДК дихромата калия
Рисунок 46. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 1 ПДК дихромата калия
В течение всего эксперимента организмы показывали нормальную активность.
11. Результаты барбуса огненного при воздействии на него дихромата калия с концентрацией 1 ПДК.
Рисунок 47. Показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия
Рисунок 48. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия
Рисунок 49. Удельный показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия
Общая активность барбуса огненного была чуть ниже норм, что говорит о том, что биотесты среагировали на добавление токсического вещества.
12. Для проведения этого эксперимента использовался дихромат калия в количестве 5 ПДК (0,005 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 7,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста – барбус суматранский.
Рисунок 50. Показатель общей активности барбуса суматранского при 5 ПДК дихромата калия
Рисунок 51. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 1 ПДК дихромата калия
Рисунок 42. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 1 ПДК дихромата калия
В течение всего эксперимента общая и поверхностная активность находились в пределах нормы. Реакции организмов на добавление токсиканта не наблюдалась.
13. 5 ПДК барбус огненный
Таблица 2
Сравнение показателей общей активности
| суматранский | огненный | |
| Медь | ||
| 1ПДК | ||
| 5ПДК | ||
| 10ПДК | ||
| Цинк | ||
| 1ПДК | ||
| 5ПДК | ||
| Хром | ||
| 1ПДК | ||
| 5ПДК |
Выводы
Исходя из полученных данных, мы можем сделать вывод, что барбус огненный более быстро реагирует на добавление токсичных веществ в воду, следовательно, этот вид более чувствителен по сравнению с барбусом суматранским.
Исследования проведённые с медным купоросом при концентрации 1 ПДК и 5ПДК показали ожидаемую реакцию.
В ходе исследования с применением ацетата цинка, была выявлена острая токсичность даже при 1 ПДК, которая составляет по рыбохозяйственному нормативу 0,01 мг/л, а согласно СанПиН 2.1.4.1074-01 – 0,001мг/л, это даёт основание полагать, что в первом случае ПДК завышена.
При воздействии дихромата калия острая токсичность не была выявлена даже при высоких концентрациях, однако через несколько дней, после окончание исследования все особи погибли. Это говорит о том, что хром имеет длительное токсическое воздействие.