Потенциометрический метод измерения рН
Потенциометрическое определение рН заключается в измерении ЭДС элемента, состоящего из двух электродов: индикаторного, потенциал которого зависит от активности ионов водорода, и электрода сравнения - стандартного электрода с известной величиной потенциала.
В качестве индикаторных электродов для измерения рН на практике применяют стеклянный и хингидронный электроды. В отдельных случаях в качестве индикаторного электрода можно использовать водородный электрод.
Для измерения рН применяют высокоомные потенциометры различных систем или pH-метры, шкала которых градуирована в милливольтах или непосредственно в единицах рН. Калибровка и проверка pH-метров проводится по стандартным буферным растворам.
При измерении рН контролируемых растворов отсчет величины рН по шкале прибора производят после того, как показания прибора примут установившееся значение. Время установления показаний определяется буферными свойствами и температурой раствора (обычно время установления показаний не превышает 2 мин).
Определение рН проводят при 25+2º С, в противном случае необходимо сделать соответствующие поправки.
При измерении рН сильно кислых и сильно щелочных растворов при температурах близких к 0º С, или при измерении рН растворов с очень малой буферной емкостью (например, дистиллированной воды) время установления показаний может достигать нескольких минут.
При измерении рН в неводных и смешанных растворителях, а также в некоторых коллоидных системах следует иметь в виду, что полученные значения рН являются условными.
Колориметрический метод измерения рН. Колориметрический метод определения рН основан на свойстве индикаторов изменять свою окраску в зависимости от активности ионов водорода в определенном интервале рН. Колориметрическое определение рН производят при помощи индикаторов и стандартных буферных растворов.
Сначала определяют приблизительную величину рН испытуемого раствора с помощью универсального индикатора, для чего 2 мл испытуемого раствора смешивают в маленькой фарфоровой чашке с 5 каплями универсального индикатора и полученную окраску сравнивают с цветной шкалой.
После приближенного определения рН испытуемого раствора выбирают 5-6 буферных растворов, пригодных для данной области рН и отличающихся друг от друга на 0,2. В одну из пробирок наливают 10 мл испытуемого раствора, в другие - выбранные буферные растворы. Во все пробирки прибавляют по 2-3 капли раствора индикатора и сравнивают окраску испытуемого раствора с окрасками буферных растворов.
рН испытуемого раствора равен рН буферного раствора, окраска которого совпадает с окраской испытуемого раствора.
Индикатор следует выбирать таким образом, чтобы предполагаемая величина рН попала в центральную часть интервала перехода окраски индикатора. Концентрация индикатора в испытуемом и буферном растворах должна быть одинаковой.
Универсальный индикатор.Состав: бромкрезолового пурпурового – 0,06 г; бромкрезолового зеленого – 0,01 г; метилового оранжевого – 0,02 г; тропеолина 00 – 0,04 г; фенолфталеина 0,04 г; тимолового синего – 0,05 г; бромтимолового синего – 0,1 г. Растворим в 95% спирте. Предназначен для колориметрического определения концентрации водородных ионов. Индикатор изменяет окраску в интервале рН 1,0-10,0.
рН | Окраска | рН | Окраска |
1,0 | красно-фиолетовая | 6,0 | зеленовато-желтая |
2,0 | розово-оранжевая | 7,0 | желто-зеленая |
3,0 | оранжевая | 8,0 | зеленая |
4,0 | желто-оранжевая | 9,0 | сине-зеленая |
5,0 | желтая | 10,0 | серовато-синяя |
Потенциометрический метод имеет преимущества по сравнению с колориметрическим, он более точен и имеет меньше ограничений, связанных с присутствием в растворе окислителей или восстановителей, с белковой или солевой ошибками. Потенциометрический метод в отличие от колориметрического может применяться для определения рН в окрашенных, мутных или гелеобразных растворах.
Стерильность. Образцы готовых лекарственных средств отбирают для контроля от каждой серии в количествах, зависящих от вида стерилизации и числа единиц (ампул, флаконов и т. д.) в серии. В случае, если лекарственное средство стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 + 0,02 МПа (1,1 + 0,2 кгс/ см2) и температуре (121 + 1) °С, образец состоит из 10 единиц. При других видах стерилизации минимальное количество образцов для анализа определяют по формуле п = 0, , где п - число единиц в образце, а N - число единиц в исследуемой серии препарата, при этом п должно быть не менее 3 и не более 40.
Испытание лекарственного средства на стерильность проводят с использованием фильтрационной установки. Испытуемое лекарственное средство растворяют или суспендируют (если в этом есть необходимость) в соответствующей стерильной жидкости и полученный раствор или суспензию пропускают через стерильную мембрану. После отмывания мембраны ее извлекают, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в колбу со 100 мл тиоглеколевой среды, вторую – в колбу со 100 мл среды Сабуро. Питательные среды с помещенными в них фильтрами выдерживают при температуре от 30 до 35ºС (тиогликолевая среда) и от 20 до 25ºС (среда Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре. Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованию испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными в первичном посеве, испытуемый препарат считают нестерильным.
Токсичность.Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола массой 19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.
За 24 ч до испытания и во время его проведения животные должны находиться в помещении с постоянной температурой. За 2 ч до взвешивания и отбора животных для проведения испытаний у них отбирают корм и воду.
Каждую серию препарата испытывают на 5 мышах. Растворитель, концентрация раствора (тест-доза) и способ введения указаны в частных статьях.
Раствор препарата, подлежащего испытанию, подогревают до 37° С и в объеме 0,5 мл вводят в хвостовую вену мыши со скоростью 0,1 мл/ с, если в частной статье нет других указаний.
Если в частной статье предусмотрен иной путь введения препарата мышам, объем раствора, вводимого в брюшную полость, под кожу или в желудок, может быть увеличен до 1 мл. Введение в желудок производят шприцем посредством инъекционной иглы, на конце которой имеется наплавленная олива, или при помощи другого приспособления, обеспечивающего поступление раствора или взвеси препарата в желудок.
Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч, если в частной статье нет других указаний.
Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из подопытных мышей.
В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах массой 20±0,5 г; в случае гибели при первоначальном испытании двух мышей повторное испытание проводят на 15 животных. Если при повторном испытании ни одна мышь не погибнет, т. е. суммарная гибель животных в двух опытах не превысит 10 %, препарат считается выдержавшим испытание. В противном случае препарат бракуют.
Для испытания на токсичность отбирают по 2 флакона или ампулы от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При количестве в серии флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или ампулы от каждой серии. Для проведения испытания из отобранных флаконов или ампул готовят общий раствор (смешанная проба). Общее количество отобранного лекарственного средства должно быть достаточным для проведения трех полных испытаний.
Пирогенность.Испытанию подлежат все лекарственные средства для парентерального применения при объеме одноразовой дозы 10 мл и более, а также при меньшей дозе, если есть указание в частной статье.
Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола, не альбиносах, массой 2-3,5 кг, содержавшихся на полноценном рационе. Каждый кролик должен находиться в отдельной клетке в помещении с постоянной температурой. Колебания температуры не могут превышать +3°С. При уборке клеток и взвешивании животных их оберегают от возбуждения (избегать шума и резких движений) .
В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны терять в массе. Взвешивание их проводят до дачи корма не менее 3 раз через день. Животные, теряющие в массе, к опыту не пригодны. В течение 3 суток перед испытанием у каждого подопытного кролика измеряют температуру. Измерения проводят ежедневно утром до дачи корма при помощи медицинского ртутного или электротермометра, позволяющего определить температуру с точностью до 0,1° С. Датчик термометра вводят в прямую кишку на глубину 7-9 см (в зависимости от массы кролика) за внутренний сфинктер на время, необходимое для достижения максимальной температуры. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5-39,5°С. Животные с более высокой или более низкой температурой для опыта непригодны. Кроме того, кроликов, впервые предназначаемых для испытания лекарственных средств, проверяют на реактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг 0,9 % стерильного непирогенного раствора натрия хлорида. В случае изменения температуры у кроликов более чем на +0,4°С животные считаются непригодными для опыта.
Не позднее чем за 18 ч до опыта кроликов переводят в помещение, в котором осуществляют испытание на пирогенность. Оно должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой, не отличающейся от температуры помещения, в котором кролики постоянно содержались до опыта, более чем на +2° С, и с колебаниями во время испытания, не превышающими 2°С, изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером накануне опыта у животных отбирают остаток корма. До и во время опыта животные корма не получают (воду дают без ограничения) .
Если нет других указаний в частной статье, для испытания отбирают не менее 2 флаконов или ампул от каждой серии, содержащей от 1000 до 10000 флаконов или ампул. При количестве в серии флаконов или ампул более 10 000 отбирают по3 флакона или ампулы от каждой серии. Из отобранных флаконов или ампул готовят общий раствор (смешанная проба). От серии, содержащей до 1000 флаконов или ампул, для испытания отбирают по 1 флакону или ампуле.
Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а также шприцы и иглы должны быть стерильными и непирогенными. Испытуемые лекарственные средства должны быть стерильными. Их вводят кроликам в ушную вену. Другие пути введения указывают в частной статье на лекарственное средство. Для каждого кролика берут отдельную иглу. Растворы испытуемых лекарственных средств, подогретые до 37°С (при отсутствии других указаний в частных статьях), вводят в количествах и растворителях, предусмотренных соответствующими частными статьями. Для испытания на пирогенность воды для инъекций предварительно готовят из нее изотонический 0,9 % раствор натрия хлорида. Натрия хлорид должен быть стерильным и непирогенным. Количество вводимого изотонического 0,9 % раствора натрия хлорида составляет 10 мл на 1 кг массы кролика. Все количество раствора, предварительно нагретого до 37° С, вводят в течение 2 мин.
Испытуемый раствор проверяют на 3 кроликах. Группа должна состоять из животных, близких по массе (отличающихся не более чем на 0,5 кг). Перед введением раствора у кролика дважды с интервалом 30 мин измеряют температуру. Различия в показателях температуры не должны превышать 0,2° С. В противном случае кролик для испытания не используется. Результат последнего измерения принимают за исходную температуру. Раствор вводят не позднее чем через 15--30 мин после последнего измерения температуры.
Последующее измерение температуры при внутривенном введении испытуемого раствора проводят 3 раза с промежутками в один час. При других путях введения - 5 раз с промежутками в один час, если в частной статье нет других указаний.
Воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у 3 кроликов меньше или равна 1,4° С. Если эта сумма превышает 2,2° С, то воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений температуры у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2° С, испытание повторяют дополнительно на 5 кроликах. В этом случае воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7° С. Если же эта сумма равна 3,8° С или больше, воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают пирогенными.
Если в частной статье на лекарственное средство нет других указаний, случаи понижения температуры у кроликов принимают за нуль.
Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для определения пирогенности повторно, но не ранее чем через 3 сут, если введенный им до этого раствор лекарственного средства или вода для инъекций были непирогенными. Если же введенный раствор лекарственного средства или вода для инъекций оказались пирогенными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов через 2 нед. При повышении температуры у кроликов в подобных случаях на 1,2° С и более они используются через 3 нед. Если исследуемые вещества обладают антигенными свойствами, то одних и тех же кроликов нельзя использовать для испытания повторно (если нет специальных указаний в частной статье).
Испытание на механические включения лекарственных средств.Под механическими включениями подразумеваются посторонние нерастворимые частицы в виде ворсинок (кроме пузырьков газа), случайно присутствующие в растворах. Другие твердые частицы не допускаются. Контроль проводится визуальным методом невооруженным глазом на черном и белом фонах. Зона контроля при просмотре должна быть освещена электрической лампой накаливания или лампой дневного света соответствующей мощности в зависимости от степени окраски растворов или материалов упаковки согласно таблице 2.
Таблица 2