Молекулярная биотехнология
Зав. редакцией канд. биол. наук М. Р. Погосбекова
Ведущий редактор Н. Н. Шафрановская
Редактор Р. Ф. Куликова
Художник Н. В. Зотова
Технический редактор Е. В. Денюкова
Корректор Р. Ф. Куликова
Оригинал-макет подготовлен Л. К. Васильевой График-дизайнеρ С. В. Машин Оператор Н. Е. Кизилова
Лицензия ЛР № 010174 от 20.05.97 г.
Подписано к печати 10.09,01. Формат 84 χ 108ι/κ>. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура NewionC. О&ьем 18,50 бум, л. Усл. печ. л. 62.16. Уч.-изд я. 62,07. Изд. № 4/9698. Тираж 5000 экз. Зак. 5185.
Издательство «Мир» Министерства РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникации 107996, ГСП-6, Москва, 1-Й рижский пер,, 2.
Диапозитивы изготовлены в издательстве «Мир»
Отпечатано в полном соответствии
С качеством предоставленных диапозитивов
в ОАО «Можайский полиграфический комбинат»,
143200, г. Можайск, ул. Мира, 93
ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ
От редактора перевода. 5
Предисловие. 7
Предисловие к первому изданию.. 9
Благодарности.. 10
Часть I. Основы молекулярной биотехнологии. 13
ГЛАВА 1. Молекулярно-биотехнологическая революция. 15
Технология рекомбинантных ДНК.. 15
Возникновение молекулярной биотехнологии.. 16
Коммерциализация молекулярной биотехнологии.. 19
Надежды и опасения. 20
Создание функциональных бактериальных плазмид in vitro. 21
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 22
ЛИТЕРАТУРА.. 23
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 23
ГЛАВА 2. Биологические системы, использующиеся в молекулярной биотехнологии. 24
Прокариоты и эукариоты.. 24
Escherichia coli 24
Появление новых генотипов в смешанной культуре биохимических мутантов бактерий.. 26
Saccharomyces cerevisiae. 27
Культуры эукариотических клеток.. 27
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 28
ЛИТЕРАТУРА.. 28
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 28
ГЛАВА 3. ДНК, РНК и синтез белка. 29
Структура ДНК.. 29
Репликация. 32
Расшифровка генетической информации: РНК и белок.. 33
Трансляция. 38
Регуляция транскрипции у бактерий.. 41
Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты.. 45
Регуляция транскрипции у эукариот. 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 47
ЛИТЕРАТУРА.. 49
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 49
ГЛАВА 4. Технология рекомбинантных ДНК.. 50
Рестрицирующие эндонуклеазы.. 50
ДОПОЛНЕНИЕ 4.1. 54
Гель-электрофорез. 54
Плазмидные векторы.. 56
Плазмидный вектор pBR322. 58
Трансформация и отбор. 58
Другие плазмидные векторы.. 60
При расщеплении ДНК рестриктазой RT образуются фрагменты с липкими концами.. 61
Скрининг с помощью гибридизации. 64
ДОПОЛНЕНИЕ 4.2. 65
Радиоавтография. 65
Иммунологический скрининг. 67
Скрининг по активности белка. 69
Клонирование структурных генов эукариот. 70
Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК.. 71
Векторы на основе бактериофага λ. 71
Космиды.. 74
Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК.. 76
Генетическая трансформация прокариот. 76
Перенос ДНК в E. coli 76
Электропорация. 76
Конъюгация. 77
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 78
ЛИТЕРАТУРА.. 78
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 79
ГЛАВА 5 Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 80
Химический синтез ДНК.. 80
Фосфорамидитный метод. 80
Применение синтезированных олигонуклеотидов. 85
Синтез генов. 86
Методы секвенирования ДНК.. 88
Секвенирование ДНК с помощью терминирующих дидезоксинуклеотидов. 89
Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro: полимеразная цепная реакция 89
Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК.. 89
Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага M13. 91
Праймер-опосредованная прогулка («Блуждающая затравка») 93
Полимеразная цепная реакция. 94
Получение с помощью ПЦР кДНК, отвечающих концам молекул мРНК.. 98
Синтез генов с помощью ПЦР. 102
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 102
ЛИТЕРАТУРА.. 103
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 104
ГЛАВА 6. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах 105
Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов. 105
Регулируемые промоторы.. 107
Получение больших количеств белковых продуктов. 108
Крупномасштабные системы.. 109
Использование для экспрессии других микроорганизмов. 111
Химерные белки.. 112
Расщепление химерных белков. 112
Применение химерных белков. 113
Включение белков в поверхностные структуры.. 115
Однонаправленное тандемное расположение генов. 117
Трансляционные экспрессирующие векторы.. 118
tac- Промотор: функциональный гибрид, полученный из trp- и lac- промоторов. 120
Стабилизация белков. 121
Рост в условиях недостатка кислорода. 122
Применение хозяйских штаммов с дефицитом протеиназ. 122
Бактериальный «гемоглобин». 122
Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина. 123
Повышение эффективности секреции.. 126
Метаболическая перегрузка. 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 130
ЛИТЕРАТУРА.. 131
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 133
ГЛАВА 7 Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем.. 135
Системы экспрессии Saccharomyces cerevisiae. 136
Векторы для S. cerevisiae. 137
Прямая экспрессия в S. cerevisiae. 137
Секреция гетерологичных белков, синтезируемых S. cerevisiae. 139
Другие дрожжевые системы экспрессии.. 140
Синтез поверхностного антигена вируса гепатита В.. 141
Синтез бычьего лизоцима С2. 142
Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых. 143
Система экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов. 144
Получение рекомбинантных бакуловирусов. 145
Синтез ß-глобина кролика в культуре почечных клеток обезьяны, инфицированных рекомбинантным SV40 146
Создание челночного вектора на основе бакуловирусов для E. coli и клеток насекомых. 146
Выделение рекомбинантного белка из клеток насекомых с помощью аффинного связывания. 149
Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих. 149
Селективные маркерные гены.. 150
Экспрессия двух клонированных генов в одной клетке млекопитающих. 151
ЛИТЕРАТУРА.. 155
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 156
ГЛАВА 8 Направленный мутагенез и генная инженерия белков. 158
Направленный мутагенез: методика. 159
Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага M13. 159
Олигонуклеотид-направлепный мутагенез с использованием плазмидной ДНК.. 161
Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации. 163
Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонукмотидных праймеров. 163
Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов на основе фага M 13: эффективный универсальный метод внесения точковых мутаций в любой фрагмент ДНК.. 165
Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов. 166
Генная инженерия белков. 168
Образование дополнительных дисульфидных связей. 168
Замена аспарагина на другие аминокислоты.. 170
Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп. 170
Повышение ферментативной активности. 171
Изменение потребности ферментов в металлических кофакторах. 172
Изменение специфичности фермента. 173
Повышение стабильности и специфичности фермента. 174
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 175
ЛИТЕРАТУРА.. 175
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 176
ЧАСТЬ II. Mолекулярная биотехнология микробиологических систем 179
ГЛАВА 9. Молекулярная диагностика. 181
Методы иммунодиагностики.. 182
Ферментный иммуиосорбентный анализ. 182
Моноклональные антитела. 184
Образование и отбор гибридных клеток. 185
Идентификация гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела. 185
Системы ДНК-диагностики.. 187
Гибридизационные зонды.. 188
Диагностика малярии. 188
Выявление аллелей ß-глобиноиого гена методом гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами 189
Выявление Trypanosoma cruzi 189
Нерадиоактивные методы детекции. 190
Геномная дактилоскопия. 192
Использование полиморфных ДНК-маркеров. 194
Молекулярная диагностика генетических заболеваний.. 195
Серповидноклеточная анемия. 195
Метод ПЦР/ЛОЗ. 196
Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦР-праймеров. 198
Мутации в разных сайтах одного гена. 199
Перспективы.. 201
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 201
ЛИТЕРАТУРА.. 202
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 203
ГЛАВА 10. Микробиологическое производство лекарственных средств. 204
Лекарственные препараты.. 204
Выделение кДНК интерферонов. 204
Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии. 207
Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии. 208
Оптимизация генной экспрессии. 208
Ферменты.. 209
ДНКаза I. 209
Альгинат-лиаза. 209
Моноклональные антитела как лекарственные средства. 210
Структура и функции антител. 211
Профилактика отторжения трансплантированных органов. 212
Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами. 212
Моноклональные антитела человека. 214
Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезируется в Е. coli. 215
Гибридные моноклональные антитела человека и мыши. 215
Производство антител с помощью Е. соli 218
Лекарственные средства против ВИЧ.. 222
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 224
ЛИТЕРАТУРА.. 224
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 226
ГЛАВА 11. Вакцины.. 227
Субъединичные вакцины.. 228
Противогерпетические вакцины.. 230
Противоящурные вакцины.. 230
Противотуберкулезные вакцины.. 231
Пептидные вакцины.. 231
Генная иммунизация. 233
Аттенуированные вакцины.. 234
Иммунизация с помощью пептида, синтезированного исходя из данных о нуклеотидной последовательности РНК вируса ящура. 235
Противохолерные вакцины.. 235
Противосальмонеллезные вакцины.. 236
Противолейшманиозные вакцины.. 237
«Векторные» вакцины.. 238
Противовирусные вакцины.. 238
Противобактериальные вакцины.. 242
Бактерии кок системы доставки антигенов. 242
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 243
ЛИТЕРАТУРА.. 244
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 246
ГЛАВА 12 Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 247
Эндонуклеазы рестрикции.. 247
Малые биологические молекулы.. 250
Синтез L-аскорбиновой кислоты.. 250
Синтез индиго. 252
Синтез аминокислот. 255
Антибиотики.. 257
Клонирование генов биосинтеза антибиотиков. 259
Синтез новых антибиотиков. 259
Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков. 260
Усовершенствование производства антибиотиков. 263
Получение 2-кето-L-гулоната промежуточного продукта синтеза L- аскорбиновой кислоты — с помощью рекомбинантной бактерии Erwinia herbicola. 265
Биополимеры.. 266
Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonas campestris с целью получения ксантановой слизи 266
Выделение генов биосинтеза меланина. 267
Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами. 268
Микробиологический синтез каучука. 270
Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов. 270
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 272
ЛИТЕРАТУРА.. 272
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 274
ГЛАВА 13. Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы.. 275
Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов. 275
Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданные методами генной инженерии 276
Перенос плазмид. 276
Изменение генов. 281
Утилизация крахмала и сахаров. 286
Промышленное производство фруктозы и этанола. 287
Получение мультиплазмидных микроорганизмов, способных утилизировать несколько соединений 289
Повышение эффективности производства фруктозы и этанола. 289
Zymomonas mobilis. 292
Получение силоса. 294
Утилизация целлюлозы.. 294
Компоненты лигноцеллюлозы.. 294
Выделение прокариотических целлюлозных генов. 296
Выделение эукариотических целлюлазных генов. 298
Манипуляции с целлюлозными генами. 300
Белок одноклеточных организмов. 301
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 302
ЛИТЕРАТУРА.. 303
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 305
ГЛАВА 14. Бактерии, стимулирующие рост растений. 306
Фиксация азота. 306
Нитрогеназа. 308
Компоненты.. 308
Генная инженерия кластера генов нитрогеназы.. 310
Гидрогеназа. 313
Метаболизм водорода. 313
Модификация генов гидрогеназ. 314
Образование клубеньков. 316
Конкуренция среди организмов, образующих клубеньки. 316
Манипуляции с генами образования клубеньков. 316
Идентификация генов образования клубеньков Rhizobium meliloti путем прямой комплементации Nod–- мутантов 319
Биоконтроль патогенных микроорганизмов. 320
Сидерофоры.. 321
Антибиотики. 322
Ферменты.. 323
Образование кристаллов льда и антифризные белки. 325
Стимуляция роста растений свободноживущими бактериями.. 326
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 327
ЛИТЕРАТУРА.. 328
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 330
ГЛАВА 15. Микробные инсектициды.. 331
Токсин, синтезируемый Bacillus thuringiensis. 332
Механизм действия и использование. 332
Идентификация генов токсинов. 335
Генная инженерия генов токсинов В. thuringiensis. 336
Клонирование и экспрессия гена, кодирующего токсин Bacillus thuringiensis, в Escherichia coli 338
Бакуловирусы как инструмент биоконтроля. 342
Механизм действия. 342
Усиление биоконтроля с помощью генной инженерии. 343
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 344
ЛИТЕРАТУРА.. 345
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 347
ГЛАВА 16. Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов 349
Рост микроорганизмов. 350
Периодическая культура. 351
Периодическая культура с добавлением субстрата. 352
Непрерывная культура. 353
Повышение эффективности ферментации.. 354
Экспрессия гена гемоглобина стимулирует синтез белка в Е. соli в условиях недостатка кислорода 355
Культуры с высокой плотностью.. 356
Биореакторы.. 357
Типичные крупномасштабные системы ферментации.. 359
Двухступенчатая ферментация в тандемных эрлифтных биореакторах. 360
Двухступенчатая ферментация в одном реакторе с механическим перемешиванием.. 362
Периодическая ферментация и периодическая ферментация с добавлением субстрата. 363
Сбор клеток.. 363
Разрушение клеток.. 365
Дальнейшая обработка. 366
Солюбилизация белков. 367
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 367
ЛИТЕРАТУРА.. 368
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 369
ЧАСТЬ III. Эукариотические системы.. 371
ГЛАВА 17. Генная инженерия растений: методология. 373
Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens. 373
Грамотрицательная почвенная бактерия. 373
Векторные системы на основе Τi-плазмид. 377
Физические методы переноса генов в растительные клетки.. 379
Бомбардировка микрочастицами.. 380
Применение репортерных генов при трансформации клеток растений.. 381
Эксперименты по экспрессии чужеродных генов в растениях. 382
Регенерация жизнеспособных фертильных растений, синтезирующих октопинсинтазу, из корончатого галла табака после делеции генов, контролирующих образование опухоли.. 383
Выделение различных промоторов и их использование. 383
Введение чужеродных генов в хлоропластную ДНК.. 384
Получение трансгенных растений, не содержащих маркерных генов. 386
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 386
ЛИТЕРАТУРА.. 387
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 388
ГЛАВА 18. Генная инженерия растений: применение. 389
Выведение растений, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам.. 389
Растения, устойчивые к насекомым-вредителям.. 389
Растения, устойчивые к вирусам.. 395
Растения, устойчивые к гербицидам.. 400
Растения, устойчивые к грибам и бактериям.. 401
Светоиндуцируемая экспрессия химерного гена, введенного в Nicotiana tabacum с помощью Ti-плазмидного вектора 403
Получение растений, противостоящих неблагоприятным воздействиям и старению.. 403
Окислительный стресс. 403
Солевой стресс. 404
Созревание плодов. 405
Изменение окраски цветков. 406
Изменение пищевой ценности растений.. 407
Аминокислоты.. 408
Липиды.. 408
Изменение вкуса и внешнего вида плодов. 410
Изменение внешнего вида. 410
Изменение вкуса. 411
Растения как биореакторы.. 412
Антитела. 412
Полимеры.. 412
Чужеродные белки, аккумулирующиеся в семенах. 413
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 413
ЛИТЕРАТУРА.. 413
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 416
ГЛАВА 19. Трансгенные животные. 418
Трансгенные мыши: методология. 419
Использование ретровирусных векторов. 419
Метод микроинъекции ДНК.. 420
Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. 422
Клонирование с помощью переноса ядра. 426
Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДНК.. 428
Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простою герпеса в соматических клетках мыши после инъекции рекимбинантною гена в яйцеклетки.. 428
Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.. 428
Трансгенные мыши: применение. 430
Трансгенный крупный рогатый скот. 433
Трансгенные овцы, козы и свиньи.. 435
Трансгенные птицы.. 436
Трансгенные рыбы.. 438
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 439
ЛИТЕРАТУРА.. 439
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 441
ГЛАВА 20. Молекулярная генетика человека. 442
Генетическое сцепление и картирование генов. 444
Обнаружение и оценка генетического сцепления учеловека. 446
Анализ сцепления методом максимального правдоподобия: логарифм соотношения шансов (лод-балл) 447
Построение генетических карт хромосом человека. 450
Генетический полиморфизм.. 450
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. 451
Полиморфизм коротких тандемных повторов. 454
Картирование локуса генетического заболевания в определенном районе хромосомы.. 456
Построение генетической карты сцепления человека с помощью метода, основанного на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов. 458
Часто встречающиеся типы полиморфизма у человека, которые можно типировать с помощью полимеразной цепной реакции.. 458
Построение мультилокусных хромосомных карт человека. 459
Локализация гена заболевания на карте сцепления. 460
Картирование с использованием радиационных гибридов. 460
Физическое картирование генома человека. 462
Построение контигов из YAC-, ВАС-и PAC-библиотек. 462
Построение контигов из космидных, P1- и λ-библиотек. 463
Транскрипционное картирование. 465
Клонирование генов заболеваний человека. 467
Выявление мутаций в генах человека. 467
Функциональное картирование. 468
Кандидатное картирование. 469
Позиционное картирование. 469
Позиционно-кандидатное картирование. 476
Программа «Геном человека». 477
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 479
ЛИТЕРАТУРА.. 481
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 482
ГЛАВА 2l. Генная терапия. 483
Генная терапия ex vivo. 487
Создание «пакующей» клеточной линии и ее использование для производства хелпер-независимого дефектного ретровируса. 492
Генная терапия in vivo. 493
Вирусные системы доставки генов. 493
Ретровирусные векторы.. 493
Аденовирусные векторы.. 494
Векторы на основе аденоассоциированных вирусов. 496
Векторы на основе вируса простого герпеса. 496
Невирусные системы доставки генов. 498
Активация предшественника лекарственного вещества («пролекарства») 503
Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов. 503
Синтез «антисмысловых» мРНК in vivo. 504
«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства. 506
Олигонуклеотиды, связывающиеся с белками: антитромбиновый аптамер. 508
Рибозимы как лекарственные средства. 508
Коррекция генетических дефектов с помощью олигонуклеотидов. 509
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 510
ЛИТЕРАТУРА.. 511
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 513
ЧАСТЬ IV. Контроль исследований в области молекулярной биотехнологии и патентование биотехнологических изобретений 515
ГЛАВА 22. Контроль применения биотехнологических методов. 517
Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК.. 518
Контроль за производством и потреблением пищевых продуктов и пищевых добавок.. 519
Химозин. 520
Триптофан. 520
Бычий соматотропин. 521
Контролируемое высвобождение генетически модифицированных организмов в окружающую среду 523
Pseudomonas syringae, не образующие кристаллов льда. 523
Открытые полевые испытания других генетически модифицированных организмов. 525
Возможная биологическая угроза, связанная с рекомбинантными ДНК.. 526
Генная терапия человека. 526
Политика в области генной терапии соматических клеток. 527
Накопление дефектных генов в будущих поколениях. 528
Генная терапия клеток зародышевой линии. 529
Клонирование человека. 529
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 530
ЛИТЕРАТУРА.. 531
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 532
ГЛАВА 23. Патентование биотехнологических изобретений 1) 533
Общие вопросы патентования изобретений.. 534
Патентование изобретений в разных странах. 536
Патентование ДНК-последовательностей.. 537
Трансгенные млекопитающие, не относящиеся к человеку. 538
Патентование многоклеточных организмов. 539
Патентование и фундаментальные исследования. 539
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 541
ЛИТЕРАТУРА.. 541
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 542
Словарь терминов. 543
Предметный указатель1) 566
Указатель латинских названий. 582
Оглавление. 584
ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ.. 592