Tobias J. W., T. E. Schrader, G. Rocap, 8 страница

свою очередь защищена метальным остатком (рис. 5.3). Такая молекулярная конфигурация и называется фосфорамидитом.

Рис. S.3. Структурная формула фосфорамидита. Такие производные всех четырех оснований - А, Т, G и С — используются для химическою синтеза ДНК ДМТ — диметокситритил, Me — метальная группа.

Цикл начинается после присоединения первого нуклеозида к стекляному шарику. Далее колонку обильно промывают каким-либо безводным реагентом (например, ацетонитрилом), чтобы удалить воду и другие нуклеофильные вещества, и продувают через нее аргон для вытеснения ацетонитрила. Затем с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ) отщепляют 5'-ДМТ (детритилирование) от присоединенного нуклеотида, с тем чтобы высвободить (экспонировать) реакционноспособную 5'-гидроксильную группу (рис. 5.4). Колонку вновь промывают ацетонитрилом для удаления ТХУ и продувают через нее аргон для удаления ацетонитрила. Процесс запрограммирован таким образом, чтобы на втором этапе в колонку одновременно вводились следующий нуклеозид (в виде фосфорамидита) и тетразол (активация и присоединение). Тетразол активирует фосфорамидит, так что 3'-фосфитная группа образует ковалентную связь с 5'-гидроксильной группой первого нуклеозида (рис. 5.5). Невключившийся фосфорамидит и тетразол удаляют продуванием аргона.

Поскольку по окончании первого этапа не все фиксированные на носителе нуклеозиды оказываются связанными с фосфорамидитом, необходимо предотвратить их взаимодействие с нуклеозидом, добавленным на втором этапе. Для этого непрореагировавшую 5'-гидроксильную группу ацетилируют с помощью уксусного ангидрида и диметиламинопиридина (кэппирование) (рис. 5.6). Если этого не сделать, то уже после нескольких циклов синтезируемые олигонуклеотиды будут различаться как по длине, так и по нуклеотидной последовательности.

Фосфиттриэфирная связь, образовавшаяся на втором этапе между нуклеотидами, нестабильна и может разорваться в присутствии кис-

Химическийсинтез,определение нуклеотидной последовательности и амплификацияДНК 83

Рис. 5.4. Детритилирование — отщепление 5'-диметокситритильной (ДМТ) группы с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Рис. 5.5. Активация и присоединение, 3'-фосфитная группа активированного фосфорамидита образует ковалентную связь с 5'-гидроксильной группой фиксированного на стеклянном шарике детритилированного нуклеозида. ДМТ — диметокситритильная группа, Me - метильная группа.

84ГЛАВА 5

Рис. 5.6. Кэппирование. Свободные 5'-гидроксильные группы непрореагировавших в первом цикле детритилированных нуклеозидов ацетилируют, чтобы предотвратить их участие в следуюшем цикле.

лоты или щелочи. Поэтому фосфиттриэфир окисляют с помощью йодной смеси до более стабильного пятивалентного фосфаттриэфира (рис. 5.7). Затем промывают колонку и повторяют весь цикл (детритилирование, активация и присоединение, кэппирование, окисление; рис. 5.1). Все описанные операции проводят до тех пор, пока к растущей цепи в соответствии с программой не присоединится последний нуклеозид. Синтезированные олигонуклеотиды связаны со стеклянными шариками; каждый фосфаттриэфир несет метильную группу; каждый гуанин, цитозин и аденин содержит защищенную аминогруппу, а на 5'-конце последнего нуклеотида находится ДМТ -группа.

Метильные группы удаляют с помощью химической обработки непосредственно в реакционной колонке. Затем отсоединяют олигонуклеотиды от спейсерной молекулы вместе с 3'-гидроксильным концом и элюируют их из колонки; далее последовательно удаляют бензоильные, изобутирильные и ДМТ-группы. 5'-конец цепи фосфорилируют ферментативным (полинуклеотидкиназа Т4+АТР) или химиче-

Рис, 5.7. Окисление. Фосфиттриэфир окисляется до пятивалентного фосфаттриэфира, что приводит к стабилизации фосфодиэфирной связи и делает ее более устойчивой к действию кислот и шелочей. ДМТ - диметокситритильная группа, Me — метильная группа.

Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 85

ским методом. Эту реакцию можно проводить и тогда, когда олигонуклеотид еще связан с носителем, но после детритилирования.

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%, Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т, е. 0,99²⁰ · 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуклеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуклеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы — изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффективной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все «неудачные» последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно.

Таблица. 5.1. Средний выход олигонуклеотидов заданной длины (л) при разных значениях средней

эффективности цикла

Эффективность, %	Средний выход, %

Применение синтезированных олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней,

1. Нуклеотидную последовательность специфических олигонуклеотидных зондов (длиной 20—40 звеньев) находят из данных об аминокислотной последовательности соответствующих белков.

2. Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6—12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом.

3. Один из вариантов линкерных последовательностей, так называемые «адаптеры», час-

86 ГЛАВА 5

Рис. 5.8. Типичные линкеры и адаптер. А, EcoRI-линкер, состоящий из 6 пар нуклеотидов. Б. EcoRI-линкер из 8 пар нуклеотидов. В. BamHI-SmaI-адаптер с BamHI-липкими концами и сайтом узнавания для SmaI.

то содержат сайты для двух и более рестрицирующих эндонуклеаз (рис. 5,8, В). С их помощью можно встраивать кДНК в вектор лигированием по тупым концам, а затем вырезать, используя другую рестриктазу, Адаптор, изображенный на рис. 5.8, В, встраивают в BamНI-сайт вектора перед включением ДНК-мишени в SmaI-сайт по тупым концам. После клонирования кДНК вырезают из вектора с помощью рсстриктазы BamHI. В этом случае вектор не должен содержать SmаI-сайтов, и ни вектор, ни кДНК не должны нести ВаmHI-сайтов,

4, Одноцепочечные олигонуклеотиды из -17—24 звеньев используют в качестве праймеров при секвенировании ДНК и проведении ПЦР.

5. Одноцепочечные олигонуклеотиды используют в качестве праймеров для сайт-специфического мутагенеза in vitro.

6. Необходимость в химическом синтезе нуклеотидной последовательности, кодирующей какой-то конкретный белок, может возникнуть тогда, когда клонирование соответствующего гена затруднено. При этом нуклеотидную последовательность гена находят из данных об аминокислотной последовательности белка. К химическому синтезу прибегают и тогда, когда кодоны, из которых состоит данный ген, плохо считываются организмом-хозяином, и уровень трансляции оказывается очень низким. В таком случае можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), при котором аминокислотная последовательность кодируемого белка остается прежней, а кодоны считываются хозяйским организмом более эффективно.

Синтез генов

Если химически синтезированную двухцепочечную ДНК предполагается использовать в качестве гена или его фрагмента, то каждую из ее цепей синтезируют отдельно. Получить короткие гены (60—80 п. н.) технически несложно: для этого синтезируют комплементарные цепи и затем отжигают их. В случае крупных генов (>300 п. н.) приходится применять специальные стратегии, поскольку эффективность каждого цикла химического синтеза никогда не достигает 100%, Например, если ген состоит из 999 пар нуклеотидов, а эффективность каждого цикла равна 99%, то доля полноразмерных одноцепочечных ДНК по окончании процесса составит не более 0,004%. Чтобы решить эту проблему, синтетические (двухцепочечные) гены собирают из модулей — (одноцепочечных) фрагментов длиной от 20 до 100 нуклеотидов.

Один из способов конструирования синтетического гена заключается в получении набора олигонуклеотидов длиной 20—60 нуклеотидов каждый с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности цепей задают так, чтобы после отжига концевые сегменты гена имели тупые концы. Каждый внутренний сегмент имеет выступающие 3'- и 5'-концы, комплементарные таковым соседнего сегмента (рис. 5.9). После сборки гена остается сшить од-

Химическийсинтез,определение нуклеотидной последовательности и амплификацияДНК 87

Рис. 5.9. Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотидов. Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двуцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.

ноцепочечные разрывы с помощью ДНК-лигазы Т4. Синтетические гены могут быть сконструированы так, чтобы помимо белок-кодирующих последовательностей они содержали концевые участки, обеспечивающие их встраивание в клонирующий вектор (сайты для рестри-цируюших эндонуклеаз), а также, если это необходимо, сигнальные последовательности для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции.

Для получения полноразмерных генов другим способом тоже вначале синтезируют специфический набор перекрывающихся олигонуклеотидов длиной от 40 до 100 звеньев. При их отжиге происходит спаривание 6—10 3'- и 5'-концевых взаимно комплементарных нуклеотидов, а между ними остаются большие бреши. Протяженность спаренных участков достаточно велика, чтобы стабилизировать всю структуру. Бреши заполняют ферментативным путем с помощью ДНК-полимеразы I Escherichia coli, использующей 3'-гидроксильные группы для инициации репликации и одноцепочечные участки в качестве матрицы. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4 (рис. 5.10).

Более протяженные гены (>1000 п. н.) обычно собирают из двухцепочечных фрагментов, каждый из которых в свою очередь состоит из 4-6 перекрывающихся олигонуклеотидов (от 20 до 60 п. н, каждый). Если после синтеза и отжига образуется достаточное количество фрагментов, то их просто соединяют друг с другом. В противном случае каждый фрагмент клонируют и амплифицируют. Двуцепочечные фрагменты последовательно соединяют друг с другом до образования полноразмерного гена. Чтобы гарантировать

88 ГЛАВА 5

Рис. 5.10.Сборка протяженного гена in vitro с участием ферментов. Вначале химическими методами синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге между ними образовывались спаренные участки длиной 6—10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4.

правильность нуклеотидной последовательности химически синтезированного гена, секвенируют каждый двухцепочечный фрагмент, а затем и весь ген.

Методы секвенирования ДНК

Исчерпывающую информацию о молекуле ДНК можно получить, только определив ее нуклеотидную последовательность. Так, секвенировав ген, часто удается установить его функцию, сравнив его нуклеотидную последовательность с таковыми для генов, функция которых уже известна. Без данных о нуклеотидной последовательности невозможно проводить исследования по молекулярному клонированию. Секвенирование того или иного фрагмента ДНК можно провести либо химическим методом, разработанным А. Максамом и В. Гилбертом, либо ферментативным, предложенным Ф. Сангером, но в

Химическийсинтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 89

Секвенирование ДНК с помощью терминирующих дидезоксинуклеотидов

F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson Proc. Nail. Acad. Set. USA 74: 5463-5467, 1977

Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro: полимеразная цепная реакция

К. В. Mullis, F. A. Faloona, S, J. Scharf, R. K. Saiki, G. T. Horn, H. A. Erich Cold Spring Harbor Symp, Quant. Biol. 51: 263-273, 1986

Создание новых методов — это необходимая предпосылка развития любой отрасли науки. Они позволяют получать недоступную прежде информацию, что в свою очередь приводит к более глубокому пониманию сути наблюдаемых явлений и стимулирует дальнейшие исследования, порождающие новые открытия. Что касается молекулярной биотехнологии, то ее основой стали такие мощные методы, как секвенирование ДНК и ПЦР. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом ферментативного копирования с остановкой удлинения цепи, осуществляемого ДНК-полимеразой, — быстрый, относительно простой, недорогой и надежный метод. Помимо того что нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК является его исчерпывающей характеристикой на молекулярном уровне, она позволяет также идентифицировать его кодирующую область, подобрать потенциальные праймеры для ПЦР, выявить мутационные изменения в гене. До появления в 1977 г. дидезоксиметода Сангера для секвенирования ДНК использовали метод сайт-специфического химического расщепления цепи (А. М, Maxani, W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 560-564, 1977). А еще

раньше секвенирование нуклеиновых кислот сводилось к определению нуклеотидных последовательностей РНК. Для этого нужный фрагмент ДНК сначала транскрибировали в РНК с помощью РНК-пол имеразы, а затем определяли нуклеотидную последовательность последней. Процедура была весьма сложной и длительной и состояла в следующем: радиоактивно меченную РНК обрабатывали различными рибонуклеазами, затем осуществляли хроматографическое разделение образовавшихся продуктов, повторно обрабатывали их ферментами, проводили щелочной гидролиз продуктов второго расщепления, осуществляли хроматографическое разделение продуктов гидролиза, определяли очередность олигонуклеотидов, основываясь на перекрывании их концевых участков, и воссоздавали исходную молекулу. С появлением дидезокси-метода эта процедура практически перестала использоваться. Теперь секвенируют не саму РНК, а ДНК, синтезированную на РНК как на матрице с помощью обратной транскриптазы, и применяют не метод Максама и Гилберта, а метод Сангера, появившийся после того, как была

создана система клонирования на основе фага M13. Возможность прямого секвенирования ДНК произвела настоящую революцию в исследовании молекулярных основ различных болезней человека и в разработке методов их диагностики и лечения. Огромное влияние на многие области исследований, в том числе и на молекулярную биотехнологию, оказала разработка метода ПЦР (Kary Mullis; U.S. patent 4,683,202), С возможностью получения больших количеств ДНК амплификацией сегментов клонированной или геномной ДНК была решена проблема клонирования ДНК-копий редких молекул мРНК, скрининга геномных библиотек, выявления генных мутаций, физического картирования хромосом и т. д. Первым практическим применением ПЦР было создание тест-системы для диагностики серповидноклеточной анемии (Saîki et al., Science 230: 1350-1354, 1985). ПЦР — это уникальная методика, равных которой нет среди других хорошо известных методов. Начиная с 1986 г. с ее помощью выполнено более 10 000 исследований, и несмотря на их огромное разнообразие, перспективы использования ПЦР представляются еще более впечатляющими.

настоящее время наиболее широко используется так называемый дидезоксинуклеотидный метод.

Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК

Дидезоксинуклеотид — это полученный искусственным путем нуклеотид, лишенный 2'- и 3'-гидроксильных групп при углеродных атомах сахарного кольца (рис. 5.11, А). У дезоксинуклеотида, входящего в норме в состав ДНК, отсутствует только 2'-гидроксильная группа (рис. 5.11,5). Удлинение цепи во время репликации ДНК происходит в результате присоединения очередного нуклеозидтрифосфата к 3'-гидроксильной груп-

90ГЛАВА 5

Рис, 5.11. А. Дидезоксинуклеотид (отсутствуют 2'- и 3'-гидроксильные группы в кольце). Б. Дезоксинуклеотид (отсутствует только 2'-гидроксильная группа).

пе последнего нуклеотида растущей цепи (рис. 5.12). И если таким очередным присоединяемым звеном является Дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК останавливается, поскольку следующий нуклеотид не может образовать фосфодиэфирную связь (рис. 5.13). Остановка синтеза ДНК — это ключевой этап дидезоксиметода, но чтобы осуществить секвенирование в полном объеме, необходимо выполнить целый ряд условий.

Первый шаг стандартной процедуры дидезоксисеквенирования состоит в гибридизации синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — изотопно меченный), и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP). Концентрацию каждого дидезоксинуклеотида подбирают таким образом, чтобы он оказался включенным по всем позициям в смеси растущих цепей, а не только в первой встретившейся ему позиции. (Напомним, что после присоединения дидезоксинуклеотида рост цепи сразу останавливается,

Рнс. 5,12. Синтез ДНК в обычных условиях. Очередной дезоксирибонуклеотид (дезоксирибонуклеозидтрифосфат; dNTP) спаривается с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. Между 3'-гидроксильной группой последнего нуклеотида в растущей цепи и α-фосфатной группой присоединяемого нуклеотида образуется фосфодиэфирная связь.

поэтому каждая цепь оканчивается 3'-дидезоксинуклеотидом.) По окончании ферментативного синтеза при участии ДНК-полимеразы в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигонуклеотидов, каждый из которых содержит праймерную последовательность (рис. 5.14).

Далее в пробирки добавляют формамид, чтобы обеспечить расхождение цепей, и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу пробирок). Это поз-

Химическийсинтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 91

Рис. 5.13. Остановка синтеза ДНК после присоединения дидезоксинуклеотида к концу растущей цепи. Фоофодиэфирная связь между концевым дидезоксинуклеотидом и следующим нуклеотидом не может образоваться из-за отсутствия 3'-гидроксильной группы.

воляет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК, даже если они различаются по длине всего на один нуклеотид. На радиоавтографе обнаруживается набор полос, отвечающих меченым фрагментам ДНК, сопоставление которых позволяет прямо «прочитать» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В примере, приведенном на рис. 5.15, первые шесть нуклеотидов этого сегмента, начиная с 5'-конца, — это AGCTGC. Самая «быстрая» полоса (радиоактивно меченный фрагмент в самом низу геля) соответствует самому короткому фрагменту и находится в дорожке ddATP; следующие полосы располагаются соответственно в дорожках ddGTP, ddCTP, ddTTP и т. д. На большинстве радиоавтографов четко различаются от 250 до 350 полос. Праймерная последовательность находится на фиксированном расстоянии (10—20 нуклеотидов) оттого сайта, по которому встроена клонированная ДНК, что позволяет легко распознать начало клонированного фрагмента.

Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага M13

Для определения нуклеотидной последовательности клонированных ДНК используются разные подходы. Один из первых основывался на

Рис. 5.14. Удлинение праймера при синтезе цепи в присутствии дидезоксинуклеотидов. В каждой из четырех пробирок образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. При этом образуется и какое-то число полноразмерных молекул ДНК. dNTP — дезоксинуклеозидтрифосфат

92 ГЛАВА 5

Рис. 5.15. Схематическое изображение радиоавтографа, получающегося при секвенировании ДНК с помощью дидезокси-метода. В каждую из лунок вносили содержимое одной из четырех пробирок, в которых находился один из дидезоксинуклеотидов: ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. Нуклеотидная последовательность считывается с радиоавтографа снизу вверх. На рисунке она приведена справа.

применении фага M13 E. coli в качестве вектора. ДНК этого фага представляет собой одноцепочечную кольцевую молекулу. Когда им инфицируют E. coli, сначала образуется двухцепочечная репликативная форма фаговой ДНК, а одноцепочечные кольцевые молекулы, которые затем упаковываются в вирионы, синтезируются на этой двухцепочечной молекуле как на матрице. Клетки, инфицированные М13, не подвергаются лизису; в них непрерывно образуются новые одноцепочечные молекулы ДНК М13, которые, проходя через клеточную мембрану, одеваются белковой оболочкой и выходят в окружающую среду. ДНК М13 содержит несущественную часть, которую можно заменить нужным фрагментом ДНК; при этом инфекционность рекомбинантных вирусных частиц сохранится. МП-система имеет следующие преимущества: выделенная двухцепочечная репликативная форма может функционировать как плазмида, а одноцепочечная фаговая ДНК — использоваться в качестве матрицы для секвенирования ДНК.

Все это позволяет использовать фаг M13 как комбинированную систему для клонирования и секвенирования ДНК. Обычно нужный фрагмент ДНК длиной примерно 500 п. н. встраивают в полилинкер, который является частью клонированного в РФ-ДНК фага М13 модифицированного гена IacZ', Рекомбинантной вирусной ДНК трансформируют компетентные клетки Е. coli ивысевают их на чашки со средой, содержащей субстрат X-Gal. При его гидролизе ß-галактозидазой образуется продукт, имеющий синюю окраску. На чашках появляются белые (бесцветные) и синие колонии. Первые отвечают клеткам, инфицированным фагом М13 со вставкой, нарушившей рамку считывания гена IacZ', вторые — клеткам, инфицированным фагом М13 с функциональным геном IacZ', не несущим вставки. Из белых колоний выделяют фаговые частицы, а из них — одноцепочечную ДНК со вставкой (рис. 5.16), Для секвенирования последней отжигают выделенную ДНК с праймером, который гибридизуется с последовательностью вблизи вставки, затем проводят дидезокси-секвенирование, электрофорез и радиоавтографию и «прочитывают» нуклеотидную последовательность вставки.

Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (примерно 2000 п. н.) используют другие стратегии. Одна из них состоит в следующем. Встраивают этот фрагмент в соответствующий плазмидный вектор и строят его подробную рестрикционную карту. Идентифицируют перекрывающиеся фрагменты вставки длиной от 100 до 500 п. н., субклонируют каждый из них в ДНК М13, секвенируют и воссоздают нуклеотидную последовательность всего исходного фрагмента. Чтобы быть уверенным в правильности полученного результата и идентификации какого-либо нуклеотида, необходимо секвенировать обе цепи по нескольку раз. Секвенирование обеих цепей облегчается тем, что каждый из субклонированных фрагментов исходной ДНК может быть встроен в ДНК М13 в противоположных

Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 93

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДН К в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помошью одного и того же лраймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

ориентациях. В результате в одном случае праймер будет инициировать синтез первой цепи, а в другом — второй.

Праймер-опосредованная прогулка («Блуждающая затравка»)

Для секвенирования очень длинных фрагментов ДНК (>5000 п. н.) описанный выше подход уже не может быть использован, поскольку число КПЗ-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухце почечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, выделяют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250—350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250—350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки.