Аппараты биотехнологического производства: амплификация гена in vitro

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификаторы принцип работы. Денатурация. Отжиг. Элонгация. ПЦР в реальном времени. Оборудование для ПЦР в реальном времени. Процесс амплификации с использованием OmniMix HS.

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биотехнологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биотехнологической практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

1. Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

3. Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

ПЦР в реальном времени. В настоящее время внедряется новая технология ПЦР — ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Оборудование для ПЦР в реальном времени:

Амплификатор Mx3005P для ПЦР-анализа в реальном времени

Характеристика амплификатора Мх3005P:

источник возбуждения: кварцевая вольфрамовая галогеновая лампа, пятипозиционное колесо фильтров канала возбуждения,

детектор: одна сканирующая трубка - фотоумножитель (PMT), пятипозиционное колесо фильтров канала детекции,

амплификатор имеет 5 фильтров по выбору пользователя: пятипозиционное колесо каналов,

возбуждения и детекции - можно выбрать фильтры для детекции следующих красителей: ALEXA Fluor® 350 (350nm-440nm), FAM™/SYBR® Green I (492nm-516nm), TET (517nm- 538nm), HEX™/JOE™/VIC™ (535nm-555nm), Cy3™ (545nm-568nm), TAMRA™ (556nm- 580nm), ROX™/Texas Red® (585nm-610nm) и Cy5™ (635nm-665nm).

термоблок: твердотельный, основанный на технологии Peltier 96-луночный блок, формат образцов: 96-луночные планшеты, стрипы из 8 пробирок, пробирки 200 мкл, оптимальный объем образцов 25 мкл.

Встроенная система защиты данных в случае сбоев электропитания или поломки компьютера

Спецификация амплификатора Мх3005P

10 порядков чувствительности на линейном участке кривой амплификации

длины волны возбуждения: 350-750 нм

длины волны эмиссии: 350-700 нм

температурное единообразие: +/- 0.25°C при 72ºC

распознавание образцов с содержанием от 5 до 10 копий ДНК-мишени с точностью 99.7% выявление одной копии ДНК-мишени

скорость амплификации: 40 циклов количественной ПЦР завершаются за 90 минут, при использовании реагентов FullVelocity SYBR QPCR & QRT-PCR - 60 минут.

размеры амплификатора Мх3005P: 33 см x 46 см x 43 см, вес 20 кг Smart Cycler II производство «Cepheid»

Новейшая версия универсального и высокоэффективного термоциклера фирмы «Cepheid» с оптическй детекцией в режиме "реального времени" (Real Time PCR).

Количественный и качественный анализ продуктов реакции амплификации на экране дисплея.

Продукты амплификации могут быть исследованы без вскрытия пробирок с амплификационной смесью, что устраняет возможность контаминации. Метод флюоресцентной регистрации продуктов амплификации позволяет количественно оценивать результаты в ходе ПЦР.

Smart Cycler II состоит из 16 независимых модулей I-CORE (Intelligent Cooling/heating Optical REaction), каждый из которых способен поддерживать заданный температурный режим. Системное обеспечение позволяет одному или нескольким исследователям проводить независимо друг от друга эксперименты с различными протоколами ПЦР, критериями оценки результатов ПЦР и анализом данных.

Высококачественная оптическая система в сочетании с продвинутым программным обеспечением обеспечивают мультиплексный количественный анализ позитивных и негативных результатов ПЦР. Smart Cycler II включает все оборудование и программное обеспечение, необходимое для получения результатов в режиме "реального времени": процессор, систему ввода информации CDSW, настольный компьютер, монитор, программное обеспечение (версия 2,0), панель управления и набор аксессуаров, состоящий из мини-центрифуги, штативов для пробирок и охлаждающего штатива, приспособленного для пробирок Smart Cycler.

Возможна также конфигурация "laptop".

Технические характеристики

Термоблоки Одновременного могут быть использованы от 1 до 6 блоков, каждый на 16 ячеек. Объем кюветы 25 и 100 мкл Пользовательский интерфейс Вывод на дисплей в режиме "реального времени" кривых роста концентрации ДНК и температурных профилей Простой графический формат позволяет быстро вводить протоколы. Автоматический переход к следующей стадии ПЦР по достижении установленного опереатором уровня. Получение результатов в "реальном времени". Хранение и импорт стандартных протоколов. Анализ данных Количественный и качественный анализ Первичный анализ по кривой роста количества ДНК и вторичный - по анализу продуктов реакции. Мультиплексный анализ с использованием внешнего контроля. Экспорт данных в виде JPEG Экспорт данных в Microsoft Excel Постоянный доступ пользователя к протоколу, графике и данным. Скорость нагревания (max.): 10 °C/сек от 50 °C дo 95 °C Скорость охлаждения (max.): 2.5 °C/сек от 95 °C до 50 °C

Температурная точность: ± 0.5 °C от 60 °C до 95 °C

Размеры Рабочий блок: 305 x 305 x 254 см Вес 8,8 кг Требования к электропитанию 100-240 V, 50-60 Hz, 350 Wt

Процесс амплификации с использованием OmniMix HS Готовые для использования лиофилизованные гранулы, содержащие компоненты для PCR, включая "hot start"-Taq полимеразу, для использования в системе Smart Cycler® Механизм "hot start" "Hot start"-продукт содержит специфичные к Taq-полимеразе моноклональные антитела для минимизации эффекта от неспецифичного связывания праймеров с ДНК-матрицей и образования праймерами димеров до начала первого цикла амплификации. Состав: OmniMix™ HS содержит все необходимые для ПЦР реагенты, кроме праймеров и флуоресцентных зондов или интеркалирующего красителя. Готовность к использованию: Не требует дополнительного времени для активации. Специфичность: Уменьшение образования неспецифического продукта и, как следствие, более качественная детекция. Простая постановка ПЦР с использованием OmniMix Предельное упрощение постановки ПЦР при использовании OmniMix HS. Исключены стадии добавления в образец растворов отдельных ингредиентов, что снижает риск контаминации и делает результаты практически стопроцентно воспроизводимыми.

Стабильность: OmniMix HS - это лиофильно высушенная смесь реактивов в виде гранул, стабильных при 2-8°C. Масштабирование: каждая пробирка 0.5 мл содержит содержит оптимальное количество OmniMix для постановки 2-х реакций амплификации в объеме 25 мкл. Для ПЦР в большем объеме можно использовать несколько гранул. Воспроизводимость: применение OmniMix позволяет легко получать прекрасно воспроизводимые результаты. Последовательность действий при постановке ПЦР с использованием OmniMix:

Новый мир возможностей генетического анализа. Системы генетического анализа – сиквенаторы (рисунок 6) CEQ 8000, CEQ 8800 и GeXP относяться к Cемейству приборов GenomeLab™. Системы генетического анализа созданы на основе технологии капиллярного электрофореза и включают в себя все наилучшие качества капиллярной технологии Beckman Coulter. Благодаря интегрированному программному обеспечению, высокой производительности, точности, специальной химии, использованию высококачественных капилляров, специальному гелю, системы CEQ8000, CEQ8800 и GeXP являются мощным инструментом анализа и передовой разработкой современного аналитического приборостроения.

Литература:

Основная – 4 [55-67].

Дополнительная – 6 [191-201].

Контрольные вопросы:

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2. Принцип работы амплификаторов.

3. Денатурация. Отжиг.

4. Элонгация. ПЦР в реальном времени. Оборудование для ПЦР в реальном времени. 5. Процесс амплификации с использованием OmniMix HS.

Лекция №6.