АТФ-зависимый протеолиз

Зависимость протеолиза от АТФ была обнаружена 25 лет тому назад, когда было показано, что недостаток АТФ способен оказывать тормозящее действие на внутриклеточный распад белков. Как АТФ участвует в деградации белков еще мало известно. В наибольшей степени изучены АТФ-зависимая протеолитическая активность, присущая растворимой фракции ретикулоцитов. По-видимому, она ответственна за избирательную деградацию аномальных белков в клетке, а также за утрату органелл в процессе созревания ретикулоцитов. Потеря этой активности в стареющих эритроцитах приводит к накоплению токсических окисленных и денатурированных белков, что, в свою очередь, отражается на продолжительности жизни клеток.

Есть основания полагать, что использование АТФ протеиназами зависимыми от АТФ сходно с использованием этого нуклеотида другими молекулярными соединениями. Гидролиз АТФ может сопровождать:

 реакции рефолдирования и дефолдирования полипептидных цепей, что делает их более доступными для протеолиза;

 транслокацию белковых субстратов к протеолитическим активным центрам протеасом;

 повышение эффективности связывания белков-субстратов с протеиназами, поскольку начальное взаимодействие между субстратом и ферментом осуществляется кинетическим механизмом «пробного считывания» для отбора только подходящих для протеолиза субстратов.

АТФ-зависимым, как это было видно из предыдущего раздела, является убиквитиновый путь деградации белка. АТФ вовлекается в этот путь протеолиза, по крайней мере в трех независимых процессах:

 ковалентное связывание убиквитина с белком-мишенью – гидролиз АТФ требуется для активации убиквитина ферментом Е1;

 формирование ансамбля 26S протеасомного комплекса, молекулярные механизмы которого еще до конца не известны;

 гидролиз связанных с убиквитином белков с участием 26S протеасом и освобождение убиквитина.

Эта утилизация метаболической энергии на основных этапах деградации белков подтверждает физиологическую возможность участия протеасомной убиквитин-зависимой протеолитической системы в селективном удалении «ненужных» и отработанных короткоживущих и быстрообновляемых белков, а также аномальных белков генерируемых в клетках. Следует заметить, что расщепление белков в интактных клетках требует значительных затрат энергии. Так, например, расход АТФ при протеолизе белков митохондрий в убиквитин-зависимой протеолитической системе достигает по меньшей мере одной молекулы АТФ на каждую расщепленную пептидную связь. Выявлены АТФ-зависимые протеиназы, осуществляющие регуляцию уровня внутриклеточного протеолиза без участия убиквитина. Итак, можно заключить что, АТФ-зависимые протеиназы играют ключевую роль в процессе регуляции внутриклеточного уровня белков и пептидов.

Протеасомы.

Протеасомами называются мультикаталитические мультифункциональные протеиназы, присутствующие в цитоплазме всех эукариотических клеток. Протеасомы являются эндопетидазами, состоящими из множества субъединиц. Эти ферменты отличаются от других известных протеиназ и представляют особую группу протеолитических ферментов, способных катализировать три типа протеолитической активности:

 трипсино-подобную

 химотрипсино-подобную

 каспазо-подобную (петидилглутамин-пептидгидролазную).

В основном белки в клетках деградируются 26S протеасомами, которые состоят из протеолитического кора и одного или двух регуляторных комплексов. Наиболее изученной является 26S протеасома, которая содержит 20S протеасомный кор с регуляторными 19Sкомплексами присоединенными к обоим концам кора. 26S протеасома с молекулярной массой 2000 kDa является гетерогенным комплексом, состоящим из 30 и более различных субъединиц. Центральный протеолитический сегмент – 20S протеасома имеет мол. Массу 750 kDa.

Протеолитический сегмент имеет форму цилиндра, состоит из 4-х гептамерных колец 2-х типов и включает 12-15 различных полипептидов. На внутренней стороне цилиндра располагаются протеолитические центры трипсино-, химотрипсино- и каспазоподобных протеиназ. Два сегмента V-образной формы (19S) закрывают с двух сторон центральный цилиндр и отвечают за АТФ-зависимое узнавание субстрата, его дефолдирование и транслокацию в протеолитический сегмент. Таким образом, 20S протеасома может обратимо ассоциироваться с рядом других белковых компонентов, образуя необычно большой комплекс 26S, который катализирует АТФ-зависимую деградацию белков, связанных с убиквитином и\или мульти- убиквитиновой цепью. Эти дополнительные компоненты протеасомного комплекса могут регулировать протеолитические функции 20S протеасомы. Именно они обеспечивают снабжение энергией протеолиз, с участием АТФ-азы, и узнавание мульти- убиквитиновой цепи в белке-мишени для деградации.

26S протеасомные комплексы выделены и охарактеризованы из многих типов клеток. Несмотря на различия в первичной и четвертичной структурах, АТФ-зависимые протеиназы имеют ряд общих свойств и сходных механизмов действия. Они состоят из множества субъединиц, ассоциированных с мультимерной АТФ-азой, и предназначены для захвата и сканирования потенциальных белков субстратов, а также отбора из них соответствующих белков для деградации. Индуцированное нуклеотидами взаимодействие между АТФ-азными субъединицами и протеолитическим кором изменяет конформацию протеолитических активных центров, делая их более доступными для больших полипептидов или больших участков белков. Различные АТФ-азные субъединицы могут связывать и, вероятно, «выбирать» белковые субстраты, а также развертывать или перемещать белки для презентации протеолитическим активным центрам. Большой размер АТФ-азных субъединиц и ряда других белков, которые могут взаимодействовать с протеиназами, особенно, с 26S протеасомами, дает возможность воздействовать на функции множеству эффекторов. В связи с этим, активность и локализация протеиназ имеют сложную систему регуляции , включающую различные метаболиты и сигналы. Известно, что для активации протеасом требуется гидролиз АТФ. Кроме того, в последние годы получены данные о регуляции активности этих протеиназ внутриклеточным кальцием, так называемый «кальциевый сигнальный путь», который зависит от перемещения кальция, связанного с клеточным циклом. Показано, что АТФ-азные субъединицы протеасом могут быть фосфорилированы, что влияет на активность этих комплексов. Некоторые субъединицы сегмента 20S содержат структурные и регуляторные мотивы последовательности аминокислот для связывания не-субстратных белков. Так, связывание гидрофобных пептидов с этими участками ферментов стимулирует активность всех 6-и активных центров.

Известно, что 26S протеасомы деградируют белки, меченные убиквитином, однако, до сих пор не ясно, как протеасомы узнают эти убиквитинированные субстраты. Нативные белки не имеют доступа к активным центрам протеасом и не подвергаются протеолизу. В цилиндрический кор протеасомы могут проникать только определенные участки денатурированных белков. При этом, химотрипсин-подобная активность может действовать как триггер, инициирующий расщепление белков в области гидрофобных остатков аминокислот, дальнейшее дефолдирование и протягивание белка через цилиндр может затем привести к расщеплению этого белка двумя другими типами протеиназ. Некоторые белки, входящие в ансамбль протеасом могут отвечать за транслокацию денатурированных цепей белка через цилиндр. В соответствии с современными представлениями, протеосомы являются физиологически важными центральными факторами, катализирующими зависимый от энергии протеолиз и играют существенную роль в нелизосомных путях катаболизма белков и процессенге антигенов. Протеасомы вовлекаясь в убиквитин-зависимый протеолиз, ответственны за элиминирование аномальных белков и короткоживущих белков, в том числе белков контролирующих прогрессию клеточного цикла, таких как циклин, антионкогенный белок р53, с-mos и другие белки. О тесной связи протеасом с апоптозом свидетельствует наличие в их составе каспазного активного центра. Каспазы – цистеиновые протеиназы, принимающие участие в проведении сигнала апоптоза, а также непосредственно отвечающие за его морфологические проявления.

Ингибирование убиквитин-зависимого протеолиза приводит к гибели клетки. Хромосомная делеция в генах, кодирующих субъединицы протеасом является летальной, что указывает на необходимость протеасом для жизни клеток.