Интеграция углеводного, липидного и белкового обмена, механизм образования общих метаболитов
4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ
Лабораторная работа:
№1. Определение активности АСТ (аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови по Райтману и Френкелю.
№2. Определение активности АЛТ в сыворотке и плазме крови ферментативным методом ( в УФ-области).
Грицук А.И. Практическая биохимия: Учебное пособие. ч.1. – Гомель, 2002. – С. 77–83.
5. ХОД ЗАНЯТИЯ.
5.1 Проведение устного теоретического опроса.
5.2 Проведение письменного контроля по теоретическим знаниям.
5.3 Выполнение лабораторных работ.
5.4 Выводы по лабораторным работам. Подведение итогов.
Лабораторная работа №1: Определение активности АСТ в сыворотке крови по Райтману и Френкелю.
ПРИНЦИП МЕТОДА: В результате переаминирования, происходящего под действием АСТ, образуется щавелевоуксусная кислота. Щавелевоуксусная кислота спонтанно декарбоксилируется в пировиноградную. При добавлении 2.4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется гидразон пировиноградной кислоты красно-коричневого
 |
цвета, интенсивность окраски которого определяется колориметрически.
ХОД РАБОТЫ. Пробирку с 0,25 мл субстратно-буферной смеси нагревают в термостате при 37°C в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови и инкубируют 60 минут в термостате при этой же температуре.
Добавляют 0,25 мл раствора 2.4-динитрофенилгидразина и выдерживают в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавляют еще 2,5 мл NaOH, перемешивают и оставляют еще на 10 минут при комнатной температуре.
Измеряют на фотометре экстинкцию опытной пробы при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистиллированной воды.
РАСЧЕТ: производят по калибровочному графику.
НОРМА: АСТ - 0,1-0,45 ммоль/ч.л (пирувата на 1 л сыворотки крови за 1 час инкубации при 37°С)
Лабораторная работа № 2: Определение активности АЛТ в сыворотке и плазме крови ферментативным методом ( в УФ-области).
ПРИНЦИП МЕТОДА: Основан на сопряжении двух ферментативных реакций (АЛТ и ЛДГ) - трансаминирования и последующего NADH-зависимого восстановлении пирувата, образующегося в процессе трансаминирования:
I этап: АЛТ
L-ала + a-кетоглутарат ¾® пируват + L-глу;
II этап: ЛДГ
пируват + NADH+H+ ¾¾¾¾® L-лактат + NAD+.
Ход реакции регистрируют по убыли восстановленной формы кофермента - NADH+Н+ имеющего максимум поглощения при 340 нм.
ХОД РАБОТЫ производить в соответствии со схемой:
I этап:
В пробирку вносят 1 мл раствора № 1 (смесь ЛДГ, NADH+Н+ буфер-субстрата, пиридоксаль-фосфата) и 0.1 мл сыворотки крови, перемешивают и термостатируют 5 мин, при 37° C
II этап:
Содержимое пробирки переливают в кювету, предварительно нагретую до 37°C, и добавляют 0.1 мл раствора № 2 (a-кетоглутарат)
Измеряют оптическую плотность при длине волны 340 нм, ширине кюветы 10 мм, в интервале 3 минут.
РАСЧЕТ: вычисляют изменение экстинкции за 1 мин (DА/Dt), а также каталитическую концентрацию (активность АЛТ) по формуле:
С = DA/Dt ´ 31.75 (мккат/л)
НОРМА:
Активность АЛТ сыворотки крови равна 0.15 - 0.96 мккат/л
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ:
Определение активности АЛТ и АСТ широко используется в ранней дифференциальной диагностике различных заболеваний. Оба фермента высокоактивны в различных тканях. Однако наибольшая активность АЛТ приходится на печень, а АСТ на миокард. В связи с высокой информативностью определение активности АЛТ используется для ранней диагностики болезни Боткина (до появления желтухи и первых симптомов болезни - недомогания, слабости и т. д.), а так же ее безжелтушных форм. Высокая активность фермента в крови поддерживается первые 10-15 дней, а затем постепенно снижается. Степень увеличения активности АЛТ коррелирует с тяжестью болезни.
АСТ более специфична для миокарда, поэтому используется для ранней дифференциальной диагностики инфаркта миокарда. Причем увеличение активности отмечается через 24-36 часов и снижается на 3-7 сутки.
6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ
1 Какое из указанных соединений является прямым донором CH3- групп:
| а) бетаин; | в) мет; | д) N5,N10-метилен ТГФК; |
| б) креатин; | г) S-аденозилметионин; | е) холин? |
2 Какие важные для нервной системы соединения образуются при декарбоксилировании аминокислот:
| а) норадреналин; | в) серотонин; | д) ГОМК; |
| б) ГАМК; | г) ацетилхолин; | е) все перечисленное? |
3 b-аланин является предшественником:
а) глутатиона; б) карнозина; в) FMN; г) NAD; д) биотина; е) HS KoA?
4 Какая из следующих аминокислот является чисто кетогенной:
а) иле; б) фен; в) лей; г) про; д) трп; е) ала?
5 Сер и цис могут вступать в ЦТК через:
| а) сукцинил-КоА; | в) ЩУК; | д) пропионат; |
| б) пируват; | г) глиоксилат; | е) ацетил КоА? |
6 Триптофан не включается в биосинтез:
| а) ниацина; | в) норадреналина; | д) индолов; |
| б) серотонина; | г) мелатонина; | е) ГАМК? |
7 Какие ферментативные реакции участвуют при биосинтезе адреналина:
| а) окисление аминогруппы; | г) декарбоксилирование; |
| б) метилирование; | д) трансаминирование; |
| в) алифатическое гидроксилирование; | е) ароматическое гидроксилирование? |
8 Какие превращения встречаются у человека:
| а) сер ® гли; | в) ЩУК ® лиз; | д) глу ® цис; |
| б) фен ® тир; | г) гомоцис ® мет; | е) ала ® гис? |
9 Какие ферментативные пары участвуют в синтезе мочевины:
а) АСТ и диаминоксидаза; б) серин-дегидратаза и глу-ДГ; в) оксидаза L-аминокислот и рацемаза; г) карбамоилфосфат синтетаза и АСТ; д) глутаминсинтетаза и глутаминаза; е) аргиназа-уреаза?
10 Какие аминокислоты, вступающие на путь ГНГ, могут ресинтезироваться из метаболитов гликолиза:
а) ала; б) глу; в) глн; г) фен; д) вал; е) мет?
11 С какими коферментами связаны превращения:
| А) пиридоксальфосфат; | а) сер ® гли; |
| Б) ТГФК; | б) ала ® пируват; |
| В) АТФ; | в) мет ® S-аденозилметионин; |
| Г) ГТФ; | г) глу ®про; |
| Д) NADPH; | д) ЩУК ®ФЕП? |
12 Серная и фосфорная кислоты являются продуктами катаболизма:
а) углеводов; б) липидов; в) белков; г) нуклеопротеидов; д) всего указанного; е) ни одного из указанного?
13 Альбинизм является результатом дефицита активности:
а) фен-гидроксилазы; б) п-оксифенилпируват-гидроксилазы; в) оксидазы гомогентизиновой кислоты; г) тирозиназы; д) карбамоилфосфатсинтетазы?
14 Алкаптонурия возникает в результате дефицита:
а) фен; б) оксидазы гомогентизиновой кислоты; в) тирозиназы; г) аргининосукцинатлиазы; д) глутаминазы?
15 Фенилкетонурия является причиной дефицита:
а) тир; б) цитруллина; в) карбамоилфосфат-синтетазы; г) гексокиназы; д) фен-гидроксилазы; е) фен?
16 Изменения активности АСТ и АЛТ у больных с заболеваниями миокарда всегда отличаются от такового у больных с заболеваниями печени. Чем это объясняется и какую диагностическую ценность имеет это различие?
17 При гомоцистинурии генетический дефект связан:
а) с мет-диметилазой; б) цистатионинсинтетазой; в) цистатионазой;
г) S-аденозин-гомоцистеингидролазой; д) нарушением транспорта аминокислот в почках?
18 Какие из следующих соединений включаются в виде прямых предшественников в биосинтез метаболитов:
| А) тир; | а) порфирин; | е) ацетилхолин; |
| Б) трп; | б) ГАМК; | ж) тироксин; |
| В) сер; | в) серотонин; | з) ниацин (PP); |
| Г) глу; | г) кинуренин; | и) креатин? |
| Д) гли; | д) адреналин; |
7. ЛИТЕРАТУРА
Основная
1 Материал лекций.
2 Биологическая химия: учебник/ В.К Кухта., Т.С.Морозкина, и др ; под ред. А.Д.Тагановича.- Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. С. 288-301
3 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 354–364; 1998. С. 451–468.
4 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 323–327, 331–338.
Дополительная
5 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1 С. 343–355.
6 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 259–267.
7 Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 653–681.
8 Врожденные и приобретенные энзимопатии / Под ред. Т. Ташева. М.: Медицина, 1980. С. 120–136.
9 Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981. С. 574–586.
Методическая разработка составлена асс. каф. биохимии Громыко М.В.