Занятие 17. Глюконеогенез, пентозофосфатный путь. Количественное определение углеводов.

Цель:изучить глюконеогенез и пентозофосфатный путь превращения углеводов, их значение. Освоить метод количественного определения глюкозы в крови.

Студент должен знать:

1. Субстрат пентозофосфатного пути превращения углеводов /ПФП/. Ключевой фермент.

2. Ветви ПФП. Лимитирующие ферменты неокислительной ветви ПФП; витамин, участвующий в образовании кофермента, его коферментную форму.

3. Продукты обеих ветвей ПФП и их использование в организме. В каких процессах участвуют продукты обеих ветвей ПФП.

4. Значение и химизм глюконеогенеза, его субстраты и их предшественники. Специфические ферменты глюконеогенеза.

Студент должен уметь:

1. На схеме катаболизма глюкозы показать место ПФП, его биологическое значение (связь окислительной и неокислительной ветвей с синтезом нуклеиновых кислот, липидов, стероидных гормонов).

2.Схематично изобразить глюконеогенез. Прогнозировать интенсивность процесса в зависимости от физиологического состояния организма.

3. Количественно определить содержание глюкозы в пробе биологической жидкости.

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1. Назовите и запомните субстрат пентозофосфатного пути (ПФП). Его ключевой фермент.

2. На схеме катаболизма глюкозы укажите место ПФП.

3. Назовите две ветви ПФП; важнейшие продукты окислительной и неокислительной ветвей их использование в организме.

4. Напишите название лимитирующих ферментов неокислительной ветви ПФП, витамин, участвующий в образовании кофермента, его коферментную форму. Использование продуктов.

5. Составьте таблицу: Пентозофосфатный путь и его значение

Ветви (пути) ПФП	Основные ферменты	Продукты образования	Использование продуктов в др. процессах
окислительная
неокислительная

6. Запишите содержание понятия глюконеогенез.

7. Назовите субстраты глюконеогенеза. Обратите внимание, что включение различных субстратов в синтез глюкозы зависит от физиологического состояния организма.

8. Изучите парциальные реакции глюконеогенеза. Обратите внимание, что большинство реакций являются обратимыми реакциями гликолиза и катализируются теми же ферментами, что и соответствующие реакции гликолиза

9. Запомните и запишите ферменты, катализирующие необратимые реакции, т.е. специфические ферменты глюконеогенеза.

10. Составьте схему (без структурных формул) глюконеогенеза.

Найдите место этого процесса на Вашей предыдущей схеме катаболизма глюкозы.

11. Назовите ткани, в которых интенсивно протекает глюконеогенез.

12. В какой ситуации (физиологическом состоянии) активность глюконеогенеза возрастает?

13. Проверьте свои знания: В гликолизе и глюконеогенезе участвуют: а. глюкокиназа; б. фосфофруктокиназа;

в. пируваткиназа; г. альдолаза; д. гексокиназа

14. Проверьте свои знания: Глюконеогенез:

а. В процессе участвует фермент, содержащий биотин;

б. Все реакции протекают в цитозоли;

в. В реакциях участвует молекула СО₂, атом углерода которой

включается в молекулу глюкозы;

г. Субстратами процесса являются аминокислоты;

д. Субстратом процесса является глицерин;

е. Субстратом процесса является лактат;

ж. Процесс активен в постабсорбционный период.

Аудиторная работа

Лабораторные работы (определение сахара в крови и моче цветной реакцией с o-толуидином).

1. Определение глюкозы в крови.

Принцип определения. Глюкоза при нагревании с о-толуидином в растворе уксусной кислоты вызывает зеленое окрашивание смеси, интенсивность которого пропорциональна содержанию сахара.

Ход работы. В центрифужную пробирку внести 0.9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты, затем по стенке внести 0.1 мл крови, взятой микропипеткой из прокола опушки пальца. Смешать, центрифугировать.

К 0.5 мл центрифугата добавить 4.5 мл ортотолуидинового реактива, поместить пробирку на кипящую водяную баню точно на 8 мин и затем сразу же охладить проточной водой до комнатной температуры. В Контрольную пробу внести вместо крови столько же 0.14 н раствора NaCl и проделать те же операции. Если жидкость после нагревания мутна – отфильтровать.

Колориметрия проводится против контроля (красный фильтр, кювета - 10 мм).

Стандартные пробы выполняются также, как опытные с той разницей, что вместо крови вносят столько же раствора глюкозы (100 мг%). Расчет по формуле:

С_оп= (С _стх Е _оп) : Е _ст

где С_оп– концентрация глюкозы в исследуемой крови, мг%;

С _ст– в стандартной пробе, Е_оп и Е_ст - оптическая плотность опытной и стандартной проб соответственно.

Выполните следующее задание:

1. Назвать важнейшую функцию глюконеогенеза и физиологическое состояние, при котором процесс наиболее интенсивный.

2. На схеме, изображающей основной путь катаболизма глюкозы (см. задание занятия №16), показать парциальные реакции глюконеогенеза (обратимые гликолизу – прямой обратной стрелкой; необратимые гликолизу - вогнутой обратной стрелкой).

3. Назвать субстраты глюконеогеза и соответственно физиологические состояния и метаболические пути и, при которых они образуются.

4. Схематично изобразить обмен лактата в печени и мышцах (цикл Кори)

5. Выберите утверждения, характеризующие физиологическое значение пентозофосфатного цикла превращения глюкозы:

а. функционирует в тканях, где активно протекают восстановительные синтезы;

б. локализован в цитозоле;

в. образуются восстановительные коферменты, используемые в реакциях восстановления;

г. образуются пентозы, используемые для синтеза нуклеотидов.

д. для функционирования необходим витамин В₁

ЗАНЯТИЕ 18. Регуляция углеводного обмена и возможные нарушения(исследование углеводного обмена).

Цель: изучить регуляцию, важнейшие молекулярные нарушения обмена углеводов и принципы контроля его состояния

Студент должен знать:

1. Почему поддержание уровня сахара крови в определенных пределах - обязательное условие нормальной жизнедеятельности.

2. Изменения концентрации сахара в крови, выход за пределы которых обозначают терминами «гипергликемия» и «гипогликемия».

3. Источники, за счет которых восполняется содержание сахара в кровотоке; пути, по которым расходуется сахар крови.

4. Регуляторные факторы, обеспечивающие гомеостаз уровня сахара в кровотоке, направление и механизмы действия этих регуляторов

5. Биохимические сдвиги, связанные с дефицитом инсулина.

6. Возможные причины появления кетонемии и кетонурии.

7. Понятие «сахарный порог почек», его значение.

8. С чем связана непереносимость дисахаридов, биохимические сдвиги при этих состояниях и принципы выявления наследственной непереносимости дисахаридов.

9. Химизм превращения галактозы и фруктозы в тканях, биохимические сдвиги при галактоземии, фруктоземии.

10. Виды гликогенозов, принципы их классификации.

11. Условия отбора проб крови для изучения показателей состояния обмена углеводов

.Студент должен уметь:

1. Обосновать необходимость лабораторной оценки состояния углеводного обмена.

2. Анализировать гликемические кривые: ориентируясь на их характер; обосновать и сформулировать предположение о направленности сдвигов в углеводном обмене.

3. Качественно определять содержание кетоновых тел в пробе биологической жидкости.

Студент должен получить представление:

1. О целях и характере лечебных мероприятий при дефиците инсулина.

2. О характере лечебных мероприятий при дефиците дисахаридаз.

3. О характере диагностических и терапевтических мероприятий при галактоземии.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

Простейшие приёмы графического анализа (построение графиков зависимости в системы координат, экстра- и интерполяция)

Задания для самоподготовки:

1.Написать пределы колебаний концентрации глюкозы в крови в условиях физиологической нормы.Дать содержание понятий: «нормогликемия», «гипо-и гипергликемия».

2. Дать содержание понятия «сахарный порог почек». При какой концентрации сахара в крови он может появиться в моче?

3. Используя собственные схемы частных метаболических путей, построить интегральную схему «Метаболизм углеводов». На схеме указать регуляторные ферменты всех частных метаболических путей.

4. Вспомните из темы « Эффекторы ферментов» механизмы регуляции активности ферментов.

5. Вспомните из предыдущих занятий процессы, направленные на повышение глюкозы в крови и процессы, направленные на снижение глюкозы (см. собственную таблицу).

6. Запишите и запомните факторы, повышающие уровень глюкозы в крови. Назовите ферменты, активность которых находится под контролем этих факторов (эффекторов), и соответствующие метаболические пути, активация или торможение которых приводит к этому состоянию.

6. Запишите и запомните факторы, понижающие уровень глюкозы в крови. Назовите ферменты, активность которых находится под контролем этих факторов (эффекторов), и соответствующие метаболические пути, активация или торможение которых приводит к этому состоянию.

7.Проверьте свои знания: Инсулин активирует следующие метаболические пути: а. синтез белка; б. глюконеогенез; в. анаэробный гликолиз; г. основной путь окисления глюкозы; д. гликогеногенез; е. гликогенолиз; ж. синтез жира.

8. Проверьте свои знания: Инсулин тормозит следующие метаболические пути: а. синтез белка; б. глюконеогенез; в. анаэробный гликолиз; г. основной путь окисления глюкозы; д. гликогенез; е. гликогенолиз; ж. синтез жира.

9. Проверьте свои знания: Глюкагон активирует следующие метаболические пути: а. синтез гликогена; б. распад гликогена; в. глюконеогенез

10. Проверьте свои знания: Глюкокортикостероиды активируют следующие метаболитические пути: а.синтез гликогена; б. глюконеогенез: в. анаэробный гликолиз.

11. Составьте таблицу: Регуляторы метаболических путей углеводов

название процессов	Регуляторные ферменты	Факторы, активирующие фермент	Факторы, ингибирующие фермент
Анаэробный гликолиз
основной путь окисления глюкоз
Гликогеногенез
Гликогенолиз
Глюконеогенез

12. Назовите биохимические сдвиги при дефиците инсулина. Нарисуйте гликемическую кривую по результатам анализа здорового человека и больного сахарным диабетом.

13. Объясните причину (биохимические механизмы) возникновения гипергликемии при сахарном диабете.

14. Кетоновые тела. Представители, субстрат образования. Физиологические состояния организма, при которых повышается интенсивность образования кетоновых тел.

15. Объясните причину (биохимические механизмы) кетонемии при сахарном диабете.

16. Изобразите в виде схемы катаболизм галактозы. Покажите на схеме фермент, дефицит которого приведет к патологии.

17. Изобразите в виде схемы катаболизм фруктозы. Покажите на схеме фермент, дефицит которого приведет к патологии.

18. Чем обусловлены врожденные пороки метаболизма?

19. Назовите виды и причины гликогенозов.

20. Назовите причины и признаки мальабсорбции.

Составьте краткое резюме по теме «Метаболизм углеводов и его регуляция».

Лабораторная работа:

Качественное определение кетоновых тел в моче:

Общие сведения. Нормальная моча содержит ацетон и другие ацетоновые (кетоновые) тела (ß-оксимасляную кислоту, ацетоуксусную кислоту, ацетон) в количествах, не выявляемых обычными приёмами. Являясь нормальными продуктами окислительного окисления жирных кислот, эти соединения быстро разрушаются в тканях с образованием воды и углекислоты. При дефиците углеводов в питании, при нарушениях их метаболизма и голодании ускоряется распад тканевых липидов. В связи с этим в тканях, а затем и в кровотоке, появляются в большом количестве недоокисленные продукты обмена липидов – ацетоновые тела. При высоком их содержании в крови ацетоновые тела выделяются с мочой – ацетон- или кетонурия.

Обнаружение ацетоновых тел основано на том, что эти продукты образуют с нитропруссидом оранжево-красное соединение (проба Легаля). Структура этого соединения при подкислении меняется, что сопровождается появлением вишневого окрашивания.

Специфичность этой реакции невелика – креатин также даёт оранжево-красное окрашивание, при подкислении которого, однако, не наблюдается переход к вишневому окрашиванию.

Ход работы. На часовое или предметное стекло нанести каплю мочи, каплю 10% раствора едкого натрия и каплю свежеприготовленного 10-% раствора нитропруссида натрия. Отметить появление оранжево-красного окрашивания, прилить 2 капли концентрированной уксусной кислоты. Появление вишневого окрашивание – признак наличия ацетоновых тел

2.Определение глюкозы в моче.0.1 мл мочи смешать с 4.5 мл о-толуидинового реактива, пробы обработать как при определении глюкозы (присутствие белка в моче определению не мешает).

Примечание: при высоком содержании глюкозы в моче или крови количество реактива может оказаться недостаточным для выявления всего продукта. В этом случае следует исследуемую жидкость разбавить в 2 раза, а результат увеличить соответственно (т.е. в 2 раза).

Ответить на поставленные вопросы (ответы аргументировать).

1. У всеядного животного, получающего рацион без углеводов с достаточным количеством белков и липидов, концентрация сахара в крови нормальна, уровень гликогена в печени снижен.

А. За счет какого процесса поддерживается уровень сахара в крови?

Б. Какие ферментные системы поддерживают этот процесс?

В. Рост содержания каких продуктов в крови и тканях можно прогнозировать?

2. Снижен сахарный порог почек. Потери сахара с мочой составляют ¼ часть от потребляемого количества углеводов.

В каком направлении изменится продукция инсулина, глюкагона, глюкокортикоидов, могут ли появиться ацетоновые тела?

3. При каких физиологических состояниях (абсорбтивный, постабсорбтивный, голодание) усиливается секреция инсулина? Глюкагона? Глюкокортикостероидов? Аргументируйте ответы с использованием интегральной схемы «Обмен углеводов».

4.Почему при нормальном функционировании поджелудочной железы интенсивная мышечная работа может вызывать гипогликемию? Возможна ли в этих условиях кетонемия?

5. Почему при сахарном диабете истощаются щелочные резервы крови?

6. Пациент направлен в биохимическую лабораторию для исследования динамики содержания сахара в крови после нагрузки глюкозой («сахарная или гликемическая кривая»). Утром натощак у него определили содержание сахара в крови, после этого предложили выпить раствор глюкозы из расчета 1,5 г на кг массы тела в 250 мл воды. Затем каждые 30 мин определяли содержание глюкозы в крови в течении 3 часов. По полученным данным построили «сахарную кривую»: а. исходный уровень сахара в крови был у верхней границы нормы; б. через 30-60 мин после приема глюкозы содержание сахара увеличилось на 80%; в. через 2 часа уровень сахара в крови снизился ниже исходного уровня; г. через 3 часа уровень сахара крови возвратился к исходному. д. при одновременном исследовании мочи глюкозурия не обнаружена. Дайте заключение по анализу. Объясните, что происходило в организме пациента на представленных этапах.

6. В крови здорового ребенка обнаружена фруктоза.

Назовите молекулярный дефект.

7. Ребенок истощен, реагирует рвотой, поносом на кондитерские изделия, плохо переносит сладкий чай. Молоко не вызывает отрицательных реакций.

Ваше предположение о молекулярном дефекте, как проверить высказанное предположение.