Получение соматостатина

Соматостатин - гормон гипоталамуса. Молекула соматостатина состоит из 14аминокислотных остатков. Соматостатин подавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальном медицинском центре был осуществлен химико-ферментативный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Участок ДНК, кодирующий гормон соматостатин, получен путем соединения тринуклеoтидов. Из 52 н. п. синтетического гена 42 пары составляли структурный ген гормона, а остальные служили для присоединения синтетического гена к плазмиде а также к сегменту лактозного оперона из генома Е. соli или к β-галактозидазному гену. Такую синтетическую чужеродную ДНК встраивали непосредственно за бактериальным геномом (или внутри его) после расщепления дик рестрикционными эндонуклеазами с образованием в результате трансляции гибридного белка. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду Е. соli вблизи конца гена, кодирующего фермент β-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После выделения рекомбинантной плазмиды в бакте­риальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибридный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от β-галактозидазы. Такой сложный способ получения гормона был необходим, так как соматостатин, синтезированный в виде свободных молекул, быстро деградирует под действием бактериальных протеаз. Первый синтез соматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10000 молекул на одну клетку.

Синтез соматотропина

Соматотропин - гормон роста человека, секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию гипофизарной карликовости. Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм, из которых пять, имеют 22 кДа, другие являются димерами, а остальные - фрагментами, образующимися припротеолизе. Это приводило к тому, что у 30 % больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность.

Будучи синтезированным в клетках Е. coli, гормон роста содержит дополнительный остаток метионина на Н₂N-конце молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка был осуществлен в 1979 г. д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кодированную ДНК; далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот,- с фен (-NH₂) долей (23), и синтетический полинуклеотид, со­ответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым АТG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре 1ас-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной био­логической активностью. Соматотропин в клетках Е. соli и в культуре клеток животных был получен в 1982 г. одновременно в Институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов соматотропина, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

1.4.Антигены и диагностикумы

Антигены - вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций (гуморальных, клеточных, иммунологической толерантности, иммунологической памяти и др.).

Свойства антигенов, наряду с чужеродностью, определяет их иммуногенность - способность вызывать иммунный ответ и антигенность- способность (антигена) избирательно взаимодействовать со специфическими антителами или антиген- распознающими рецепторами лимфоцитов.

Антигенами могут быть белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты в комбинации между собой или липидами. Наибольшей иммуногенностью обладают белковые антигены, в том числе бактериальные экзотоксины, вирусная нейраминидаза.

Диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроор­ганизмов или определенные антигены.

Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства.

Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.

В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы.

Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.

Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сен­сибилизированные антителами.

Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации.

Применение препаратов

Успешное применение вакцин заключается в правильном выборе способа вакцинации. Вакцины могут вводиться в организм накожно, подкожно, внутримышечно, на слизистые оболочки рта, неба, кишечника и внутривенным способом. Наиболее широкое применение вакцин получил подкожный метод иммунизации. Он дает возможность точно дозировать количество антигена, который вводится, простой в техническом отношении и обеспечивает длительную «иммунизирующее» действие.

Вакциныиз живых бактерийприменяютоднократно.

При использовании всех других вакцин, даже с образованием "депо" однократное введение антигена не обеспечивает формирование высокого уровня иммунитета. Вакцины вводятся в организм 2-3 раза. Интервал между инъекциями антигена обычно равен 7-10-12 дней.

Для анатоксинов применяется другая схема иммунизации. После двукратного введения третью прививку препарата - ревакцинация - делается через 3-6 месяцев. Такая схема иммунизации, как показали опыты Здродовский П.Ф. и ряд других авторов, дает возможность получить максимальное накопление антител и победить иммунологическую инертность индивидов, которые не реагируют на однократное введение антигена.

В связи с тем, что искусственно созданный иммунитет после вакцинации сохраняется относительно не долгое время, который определен максимум 10 годами, прививки против одного и того же заболевания в течение жизни производится несколько раз, например, против оспы, кишечных и др. инфекций.

Вакциныдля лечения применяютсяпри хронических, локализованных, вялотекущих заболеваниях. Лечебный эффект вакцины связан с увеличением общей иммунологической реактивности организма, которая бывает слабой при хронических болезнях, а также со специфическим действием на организм антигена, который вводится.

Препараты интерферона применяют при лечении и профилактики всех респираторных заболеваний, большинства онкозаболеваний, для лечения многих вирусных заболеваний и гриппа. Препараты интерферона широко применяются в лечении гепатита В и С: интерферон ограничивает развитие вируса, препятствует возникновению цирроза и исключает смертельный исход.

У некоторых препаратов интерферона имеются побочные эффекты, например, кожные высыпания, аллергии и заболевания кроветворной системы.

При длительном приеме интерферона в организме вырабатываются антитела к интерферону, что делает его неспособным к борьбе с вирусами. Причина этих явлений кроется в наличии альбумина в препаратах на основе интерферона.

Для лечения тяжелой формы сахарного диабета больному необходим инсулин (инсулин зависимая форма заболевания). Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 кг исходного сырья.

Гормон соматотропин, полученный в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важен для успешного лечения заболеваний, обусловленных недостатком этого гормона, и ряда патологических заболеваний, таких, как некоторые формы диабета, регенерация тканей после ожогов и др. Предполагаем, что его можно ис­пользовать и для увеличения массы и роста домашних животных, так как он, не обладая видовой специфичностью, способен сти­мулировать освобождение гормона роста у ряда животных.

В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции.

В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы:

1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных.

2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглю­тинации с сывороткой больных.

3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Исполь­зуются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью.

4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.

5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона.

6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции.

7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства.

8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа.

9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветления) и инактивируют химическими веществами.

Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания.

Заключение

В ходе данной работы мы выяснили, что препараты генной инженерии – это белковые, биологические вещества, представляющие ценность для медицины.

Принцип создания генно-инженерных вакцин заключается в том, что геном живых вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена возбудителя, против которого будет направлена вакцина.

Там, где хорошо налажена первичная медицинская помощь и большинство населения понимает, что вакцинация необходима и полезна, уровень охвата ею обычно высок независимо от пути введения вакцин и числа инъекций. Однако для того, чтобы вакцинация, требующая трех- или четырехкратных прививок, была доведена до конца, необходим неустанный контроль. Не менее необходим он и для своевременной ревакцинации.

Несмотря на успехи в создании вакцины против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полимиелит, традиционные вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности.

Интерферон синтезируется в организме постоянно. Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, кроме противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.

В настоящее время гормон роста синтезируют методами генной инженерии в специально сконструированных клетках бактерий.

Антигенами являются любые структуры, несущие признаки генетической чужеродности и распознаваемые в этом качестве иммунной системой.

Цель данной работы достигнута, поставленные цели выполнены.

Список литературы

1) Н.В. Медуницын , Вакцинология.- 1999,272стр.

2) О. К. Поздеев , Медицинская микробиология, 2001-786стр

3)А.А.Воробьев,Медицинская микробиология, вирусология и иммунология,2004,668стр.