Исследование влияния концентрации растворенного кислорода на скорость роста микроорганизмов

1. Цель работы. Освоить метод оксиметрического определения концентрации растворенного кислорода и скорости его потребления микроорганизмами. Научиться снимать зависимость скорости роста аэробных микроорганизмов от концентрации растворенного кислорода, находить критическую концентрацию кислорода и константу Моно.

2. Основные положения. По отношению к молекулярно растворенному кислороду микроорганизмы делятся на 3 группы: аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы (или факультативные аэробы). Аэробы нуждаются в кислороде, используя его в качестве акцептора электронов окисляемых веществ. Анаэробы не используют молекулярный кислород, напротив, он ингибирует их рост. Безусловные (облигатные) анаэробы способны расти только при очень низком содержании кислорода в питательном растворе (при концентрации кислорода менее 0,01 мг/л). Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии кислорода, так и без него. В аэробных условиях, когда в среде содержится кислород, факультативы ведут себя как аэробы. При низких концентрациях кислорода (менее 0,1 мг/л), т.е. в условиях, близких к анаэробным, факультативные формы переходят на анаэробный метаболизм, т.е. растут подобно анаэробам. Однако переключение клеточного метаболизма с аэробного на анаэробный (а также с анаэробного на аэробный) требует значительного времени (около 2¸3 клеточных генераций). Поэтому при быстром (в течение нескольких минут) уменьшении концентрации растворенного кислорода факультативы ведут себя как аэробы даже при содержании кислорода менее 0,1 мг/л.

Когда кислород является лимитирующим рост фактором, то его влияние на удельную скорость роста микроорганизмов (аэробов или факультативных аэробов при быстром уменьшении концентрации кислорода) описывается уравнением Моно:

, (4.1)

где	– удельная скорость роста, час-1;
	– максимальная удельная скорость роста, час-1;
	– концентрация растворенного кислорода, мг/л;
	– константа насыщения (константа Моно), мг/л.

Для аэробных бактерий константа имеет очень низкие значения (около 0,1 мг/л). Это создает экспериментальные трудности в ее определении. По этой причине иногда находят критическую концентрацию ( ) растворенного кислорода, определяемую как концентрация кислорода, ниже которой скорость роста микроорганизмов падает. При математическом описании вводят кусочно-линейную аппроксимацию уравнения Моно:

(4.2)

Зависимости (4.1) и (4.2) приведены на рис. 4.1. Как видно из графика, константа Моно ( ) численно равна концентрации кислорода, при которой удельная скорость роста равна половине максимальной.

Если удалось экспериментально снять зависимость (4.1) и получить значение , то критическая концентрация вводится по соотношению:

. (4.3)

Если точность экспериментальной техники не позволяет получить зависимость в области низких концентраций кислорода, то определение невозможно. В этом случае находят критическую концентрацию непосредственно по экспериментальным данным (рис. 4.2).

Рис. 4.1. Зависимость по уравнению Моно (-¾¾) и согласно кусочно-линейной аппроксимации (××××××××)

Рис. 4.2. Определение по экспериментальным данным

Метод прямого определения скорости роста микроорганизмов является трудоемким и имеет невысокую точность. Упростить технику эксперимента и повысить его точность можно, перейдя к измерению скорости потребления кислорода, которая связана со скоростью роста соотношением:

, (4.4)

где	- экономический коэффициент (прирост биомассы на единицу потребленного субстрата), мг биомассы/мг субстрата;
	- энергетический коэффициент (потребление кислорода на единицу потребленного субстрата), мг кислорода/мг субстрата;
	- концентрация биомассы, мг биомассы/л;
	- скорость потребления кислорода микроорганизмами, мг кислорода/л.

Если в ходе эксперимента значения параметров , , были постоянны, то и прямопропорциональны:

. (4.5)

Следовательно, зависимость будет такой же, как зависимость . Тогда значения константы Моно ( ) и критической концентрации ( ) можно найти, получив экспериментально зависимость .

Зависимость скорости роста или скорости потребления кислорода от его концентрации в водной среде необходима для расчета систем аэробной биологической очистки сточных вод (аэротенков), а также для описания микробиологических превращений в водоемах.

В аэротенках микроорганизмы находятся в виде хлопьев активного ила, состоящих из тысяч бактериальных клеток. Внутрь хлопьев кислород проникает за счет диффузии. Вследствие диффузионных процессов концентрация кислорода внутри хлопьев ила существенно меньше, чем в растворе. Так как экспериментально определяется концентрация кислорода в растворе, то зависимость от нее скорости роста микроорганизмов активного ила растягивается по оси абсцисс в сравнении с аналогичной зависимостью для свободноплавающих бактерий. Собственно, константа и критическая концентрация кислорода увеличиваются. Поэтому для активного ила типичные значения составляют 0,5¸2 мг/л, т.е. примерно в 10 раз больше, чем для свободно плавающих клеток.

Задание.

1. Приготовить модельную сточную воду.

2. Снять кинетическую кривую потребления кислорода активным илом в системе «активный ил - модельная сточная вода».

3. Обработать экспериментальные данные и получить зависимость скорости потребления кислорода от его концентрации, а также значения константы Моно и критической концентрации растворенного кислорода.

Ход работы.

1. Приготовление модельной сточной воды.

Модельная сточная вода готовится по одному из трех вариантов (вариант задается преподавателем).

Вариант I. В 1 литре предварительно отстоянной и аэрированной водопроводной воды растворить 500 мг глюкозы (можно использовать сахарозу или ксилозу), 54 мг хлористого аммония ( ) и 13 мг дигидрофосфата калия ( ). Контролировать рН. Если рН оказался ниже 6,5, то добавить раствор едкого натра (NaOH), чтобы выполнялось рН=6,5¸8,0. Полученная модельная сточная вода имеет БПК₅=300 мг/л и содержит азот и фосфор в соотношении:

БПК₅:N:Р=100:4:1

Вариант II. Черный сульфатный щелок развести в 100 раз водопроводной водой и добавить биогенные соли ( , или ) из соотношения БПК₅:N:Р=100:4:1 (величина БПК₅ разбавленного щелока задается преподавателем). Полученный раствор нейтрализовать серной кислотой до рН=6,5¸8,0. Описанными методами моделируется вода сульфатно-целлюлозного производства.

Вариант III. Модельная сточная вода сульфитно-целлюлозного производства готовится разбавлением отработанного сульфитного щелока так же, как в варианте II, но для нейтрализации используется раствор едкого натра.

2. Получение кинетической кривой потребления кислорода активным илом.

Наиболее точно потребление кислорода измеряется оксиметрическим методом. Принцип метода состоит в следующем. Насыщенную кислородом сточную воду смешивают с активным илом и помещают в сосуд с мешалкой. Затем в сосуд помещают датчик анализатора кислорода (оксиметра) таким образом, чтоб обеспечить герметичность сосуда и полное отсутствие в нем воздуха. Включают перемешивание. В результате потребления кислорода микроорганизмами его концентрация падает. Концентрация кислорода непрерывно измеряется оксиметром и фиксируется на ленте самописца, где вычерчивается кинетическая кривая . Схема лабораторной установки для измерения потребления кислорода активным илом приведена на рис. 4.3.

Рис. 4.3. Схема установки для измерения потребления кислорода активным илом:

1 – оксиметр (кислородомер); 2 – датчик оксиметра (кислородомера); 3 – рабочий сосуд с активным илом; 4 – ванна термостатирования; 5 – магнитная мешалка; 6 – перемешивающее устройство; 7 – лабораторный трансформатор (латр); 8 – самописец; 9 – термостат

При выполнении работы необходимо соблюдать определенную последовательность операций:

· Измерить объем жидкости (воды) в сосуде 3 при погруженном в него датчике 2. Для этого в сосуд наливают воду и опускают датчик так, чтобы часть воды вытеснилась из сосуда и вылилась в ванну 4. Затем датчик вынимают, а воду переливают в мерный цилиндр и измеряют ее объем (V).

· Рассчитать объем ила (V_и) и сточной воды (V_в) так, чтобы выполнялось:
V_и+V_в=V
V_в:V_и»4.

· Отобрать из лабораторного аэротенка иловую смесь объемом около 5 V_и и поместить ее в цилиндр для отстаивания. Когда объем, занимаемый осевшим илом, станет меньше V_и, слить сифоном надосадочную воду до отметки V_и. Активный ил объемом V_и из цилиндра перелить в сосуд 3 с перемешивающим устройством 6.

· Модельную сточную воду объемом V_в, предварительно насыщенную кислородом (аэрация в течение 5 мин. от микрокомпрессора), перелить в сосуд 3 с перемешивающим устройством 6.

· Опустить в сосуд с мешалкой датчик 2 оксиметра 1. Убедиться, что в сосуде отсутствуют пузырьки воздуха (могут прилипать к датчику), а жидкость занимает весь объем сосуда.

· Выставить на латре 7 напряжение U=150 В и включить магнитную мешалку 5. Убедиться, что обеспечивается хорошее перемешивание иловой смеси.

· Включить перо и ленту самописца 8. Убедиться, что показания оксиметра и самописца совпадают. Контролировать ход процесса, наблюдая за лентой самописца.

· Когда концентрация кислорода снизится до 5 мг/л, включить на оксиметре новый диапазон 0¸5 (исходное положение переключателя диапазонов оксиметра должно быть 0¸20). На диапазоне 0¸5 цена деления шкалы оксиметра составляет 0,2 мг/л, что позволяет производить визуальные измерения (по шкале оксиметра) более точно, чем отсчет по ленте самописца. Поэтому в момент, когда С=5,0 мг/л, включаем секундомер и снимаем показания по шкале оксиметра, занося результаты в таблицу (см. табл. 4.1).

Таблица 4.1

Результаты определения кинетики потребления кислорода

Активным илом

t, сек.								...				...
С, мг/л	5,0	4,8	4,6	4,4	4,2	4,0	3,8	...	2,0	1,9	1,8	...

Когда концентрация кислорода снизится до 2 мг/л, переходим на шкалу 0¸2, имеющую цену деления 0,1 мг/л. Продолжаем отсчет времени через каждые 0,1 мг/л (см. табл. 4.1), пока концентрация кислорода не достигнет нуля.